论文摘要
一、背景和目的：原发性肝癌（primay hepatic cancer，PHC）是全世界最常见的恶性实体肿瘤之一，也是第三大癌症相关性死亡因素，每年至少有50万新发病例。包括中国东南，台湾，香港，韩国，泰国，新加坡，马来西亚的东南亚地区和热带非洲国家是全球发病率最高的地区，年发病率10-20／10万，且发病率呈上升趋势。大多数肝癌合并有肝硬化，主要的致病因素有病毒性肝炎，酗酒及黄曲霉素的摄入。肝癌患者预后较差，未经治疗的肝癌患者的自然生存时间仅为8．4个月。肝切除术是治疗肝癌的有效方法，然而只有10-20％的肝癌在诊断时具有可切除性。化疗是肝癌治疗重要的辅助手段。但传统的静脉化疗虽然有一定的效果，但全身副作用较大，患者往往难以耐受。因此改变给药途径，即通过局部或区域性给药，能大大提高肿瘤区域内化疗药物的浓度，增加化疗药物对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用，并有效地降低了全身副作用。随着抗肿瘤药物缓释剂型的技术改进和对给药途径的观念更新，区域性化疗：即腹腔内化疗、肝动脉灌注化疗、门静脉灌注化疗、间质化疗等方法，日益成为治疗肝癌的有效方法及手段。而间质化疗是当前研究的热点。所谓间质化疗（interstitialchemotherapy，IC），即将抗癌药制备成具有缓释作用的给药系统，经不同方式植入（注入）肿瘤组织、瘤周组织的间质中或肿瘤切除后的瘤床，从而达到局部组织的持续、高效的药物浓度，同时降低全身的不良反应。有鉴于此，从上个世纪90年代开始，国外部分学者和吴院士开始进行肝癌间质化疗的研究。在成功进行了肝癌腹腔内化疗、肝动脉灌注化疗、门静脉灌注化疗等方法的基础上，开始间质化疗的实验研究，并且从2003年开始尝试将缓释化疗药物植入肝癌组织、癌周组织中或肝癌切除后的瘤床。本课题拟通过细胞实验来证实植入用缓释5-FU能持续抑制肝癌细胞的生长，导致肝癌细胞的凋亡，并且5-FU是以时间依赖性方式抑制肝癌，所以进一步充实植入用缓释5-FU应用于临床的理论依据。并且通过300例肝癌患者，按随机数字表分为5-FU缓释微粒植入组和对照组。植入组150例在肝癌切除术中同时植入缓释5-FU微粒600mg，随访其术后的复发率以及生存率来具体评估肝癌间质化疗的疗效，以期得到指导肝癌间质化疗的证据。二、研究方法（一）MTT（噻唑蓝）法检测植入用缓释5-FU抑制人肝癌细胞生长的实验1．HepG2肝癌细胞培养用植入用缓释5-FU100mg放入2ml dulbecco’s modified eagle’s medium（DMEM）培养液中，分别取植入用缓释5-FU释放后第0d，第1d，第7d，第14d，第21d和第28d的培养液来培养HepG2肝癌细胞。2．观察HepG2细胞增殖形态培养72h后于倒置相差显微镜下拍摄细胞状态。3．MTT法检测HepG2细胞增殖培养72h后加入MTT继续孵育，4 h后终止培养。用酶标仪在560 nm波长下测定吸光度A，细胞存活率（％）=（试验孔A值／对照孔A值）×100％。（二）植入用缓释5-FU诱导肝癌细胞凋亡的实验研究1．取植入用缓释5-FU释放后第0d，第1d，第7d，第14d，第21d和第28d的培养液来培养HepG2肝癌细胞72h。采用Hochest染色试剂盒检测细胞凋亡。2．用缓释5-FU浸泡第0d，第1d，第7d，第14d，第21d和第28d的培养液培养HepG2细胞72h后，用Annexin-V-FITC和PI染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡。（三）肝癌行肝脏切除术中植入缓释5-FU的临床试验300例肝癌患者，按随机数字表分为5-FU缓释微粒植入组和对照组。植入组在肝癌切除术中将缓释5-FU微粒600mg植入肝创面。全部患者术后均定期随访。三、结果：（一）MTT（tetrazolium salt,噻唑蓝）法检测植入用缓释5-FU抑制人肝癌细胞生长的实验1．HepG2细胞经植入用缓释5-FU处理，可见部分细胞变圆、变钝，细胞体积变小，伴核固缩，细胞由贴壁脱落，悬浮于培养液中，尤以浸泡21天和28天后的处理24h为甚；而对照组则细胞成片生长，饱满舒展，贴壁并少有脱落。2．MTT检测结果显示，植入用缓释5-FU释放后第0d，第1d，第7d，第14d，第21d和第28d的培养液处理HepG2细胞72h后，细胞存活率分别为99．5％±8．2％、78．3％±6．2％、43．2％±4．5％、26．3％±3．2％、14．7％±2．2％和11．6％±1．5％。植入用缓释5-FU以时间依赖性方式抑制肝癌细胞生长。（二）植入用缓释5-FU诱导肝癌细胞凋亡的实验研究1．用Hochest染色观察到随着缓释5-FU释放时间的延长，凋亡细胞数目也随之增加，其变化趋势同MTT的结果基本一致。2．流式细胞仪检测结果提示，随着缓释5-FU释放时间的延长，早期凋亡细胞数依次为0％、1．19％、2．26％、3．69％、4．92％和17．92％；呈逐渐升高趋势，坏死和晚期凋亡细胞数依次为0．10％、1．33％、3．77％、4．95％、6．27％和9．35％；总凋亡数依次为0．10％、2．52％、6．03％、8．64％、11．17％和27．27％，也呈逐渐升高趋势。（三）肝癌行肝脏切除术中植入缓释5-FU的临床试验植入组术后2、3年肿瘤复发率分别为14．0％和23．3％，与对照组23．3％和34．7％比较（0．01<P<0．05）；4、5年肿瘤复发率分别为32．0％和43．3％与对照组47．3％和59．3％比较（P<0．01）有统计学意义；植入组的5年生存率明显高于对照组（P<0．01）。四、结论：（一）MTT检测结果显示，植入用缓释5-FU可以在28天内持续释放，并且缓释5-FU以时间依赖性方式抑制肝癌细胞生长。（二）Hochest染色从形态学角度直观地观察到缓释5-FU以时间依赖性方式导致HepG2细胞的凋亡增加。（三）流式细胞仪检测到缓释5-FU随着释放时间的延长对HepG2细胞凋亡比例增加。（四）肝癌行肝切除术中植入缓释5-FU不良反应轻微，安全、简便、有效，在一定程度上能有效地降低术后局部复发率，提高治疗效果，能延长肝癌患者的生存期。
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