HIV-1非人灵长类易感动物模型前期研究

论文摘要

艾滋病研究尚缺乏合适的动物模型。非人灵长类动物模型被认为是研究艾滋病毒（HIV-1）感染的理想动物模型,但天然抗逆转录病毒的限制因子的存在限制了HIV-1的跨种间感染。近年研究表明TRIM5α和APOBEC3G（A3G）是主要的限制因子。猴TRIM5α结合HIV-1的衣壳蛋白（CA）而限制其复制,而一些旧大陆猴中发现了TRIM5α的一种CypA基因插入剪接突变体TRIMCyp,其失去了对HIV-1的限制。A3G主要包裹在病毒颗粒中,对第二轮的感染具有限制作用,且这种限制作用具有种属特异性,即人A3G不能限制HIV-1的复制,却对猴艾滋病毒（SIV）具有限制作用。反之,猴的A3G不能限制SIV,却能限制HIV-1。这种种属的特异性只由数个氨基酸位点决定,若突破这两种限制,则HIV-1有可能感染猴。本研究首先对SIV的SIVmac239与猴/人艾滋病毒的SHIV89.6P这两株病毒进行拯救、鉴定、并定量,作为后续动物感染实验的参考毒株。此外,本文首次应用毛发PCR法对中国品系猕猴TRIMCyp进行了筛选,并在食蟹猴中筛选出了TRIMCyp纯合子个体,建立了可靠的毛发检测方法,仅需一到两根毛发即可满足对基因组DNA的提取,减少了采血检测对猴体的伤害。在此基础上,首次对中国TRIMCyp纯合子个体食蟹猴A3G基因进行克隆表达,并在该基因决定种属特异性关键性限制位点进行突变,进行了限制性实验研究。同时,对人APOBEC3G基因也进行了克隆表达,并根据猕猴序列,在相应位点进行了点突变,作为参照。研究结果表明食蟹猴A3G基因的以上突变失去了对HIV-1复制的限制。本文研究为建立HIV-1易感食蟹猴模型提供了重要参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 艾滋病概述
• 1.1.1 HIV-1 病毒粒子结构
• 1.1.2 HIV 基因组结构及功能
• 1.2 TRIM5α 研究进展概述
• 1.2.1 TRIM5α结构域的作用
• 1.2.2 TRIM5α作用方式
• 1.2.3 阻止病毒正常脱壳
• 1.2.4 TRIM5α的泛素连接酶活性
• 1.2.5 TRIMCyp
• 1.3 APOBEC3G 研究进展概述
• 1.3.1 APOBEC3G 的发现
• 1.3.2 APOBEC3G 的结构与功能
• 1.3.3 Vif 蛋白抗APOBEC3G 的策略
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验所用菌种
• 2.1.2 实验所用细胞及毛发
• 2.1.3 主要试剂与试剂盒
• 2.1.4 本论文中所使用的仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒DNA 的小量制备
• 2.2.2 质粒的中量提取与大量提取
• 2.2.3 脂质体法质粒DNA 转染
• 2.2.4 逆转录酶活性检测
• 2.2.5 间接免疫荧光检测
• 2.2.6 恒河猴PBMC 的分离
• 2.2.7 HIV-1 p24 标准定量检测检测（酶联免疫法）
• 2.2.8 毛发DNA 提取
• 2.2.9 血液DNA 的小量提取
• 2.2.10 血液RNA 的小量提取
• 2.2.11 cDNA 的合成
• 2.2.12 目的基因的扩增
• 2.2.13 DNA 片段的纯化回收
• 2.2.14 重组质粒APOBEC3G-human 和APOBEC3G-crab 的构建
• 2.2.15 点突变质粒mAPOBEC3G-human 和mAPOBEC3G-crab 的构建
• 2.2.16 病毒粒子的浓缩
• 2.2.17 重组蛋白westren blotting 检测
• 第三章 结果
• 3.1 SIVmac239 病毒拯救及鉴定
• 3.1.1 SIVmac239 转染293T 反转录酶（RT）活性检测
• 3.1.2 SIVmac239 转染上清接种TZM-bl 后间接免疫荧光检测
• 3.1.3 SIVmac239 转染上清接种CEMX174 后细胞病变观察
• 3.1.4 SIVmac239 转染上清接种CEMX174 后电镜观察
• 3.1.5 SIVmac239 在CEMX174 细胞中复制动力学
• 3.1.6 SIVmac239 在恒河猴PBMC 中复制动力学
• 3.2 SHIV89.6P 病毒拯救及鉴定
• 3.2.1 SHIV89.6P 转染293T 反转录酶（RT）活性检测
• 3.2.2 SHIV89.6P 转染上清接种CEMX174 后细胞病变观察
• 3.2.3 SHIV89.6P 转染上清接种CEMX174 后电镜观察
• 3.2.4 SHIV89.6P 在CEMX174 细胞中复制动力学
• 3.2.5 SHIV89.6P 在恒河猴PBMC 中复制动力学
• 3.3 应用毛发 PCR 法检测猕猴属 TRIMCyp 突变个体
• 3.3.1 平顶猴TRIMCyp 突变个体检测结果
• 3.3.2 恒河猴TRIMCyp 突变个体检测结果
• 3.3.3 食蟹猴TRIMCyp 突变检测结果
• 3.4 人、食蟹猴APOBEC3G 基因克隆以及功能检测
• 3.4.1 人APOBEC3G 基因克隆与鉴定
• 3.4.2 食蟹猴APOBEC3G 基因克隆与鉴定
• 3.4.3 人、食蟹猴APOBEC3G 基因128 位进行点突变
• 3.4.4 人、食蟹猴APOBEC3G 基因以及点突变后表达鉴定
• 3.4.5 人、食蟹猴APOBEC3G 基因以及点突变后功能验证
• 第四章 讨论
• 4.1 参考毒株的选择
• 4.2 病毒的拯救
• 4.3 毛发 PCR 法对 TRIMCyp 突变猴的检测
• 4.4 关于APOBEC3G 功能性试验
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历