FHL1通过抑制微管形成介导肝癌细胞对紫杉醇耐药

论文摘要

肝癌是常见的恶性肿瘤之一,在消化道肿瘤中占第三位。FHL1是FHL家族中的一员,已有研究表明,FHL1在肝癌中发挥了抑癌基因的功能。本研究旨在较深入的探讨FHL1在肝癌中发挥功能的机制,为肝癌的治疗提供线索。利用免疫共沉淀和蛋白质双向电泳技术我们获得了与FHL1相互作用的蛋白-p微管蛋白,α微管蛋白和p微管蛋白是组成微管的两个重要成员,二者具有40%的同源性。经研究发现,FHL1与α-tubulin在体内外均存在相互作用,并调节α-tubulin乙酰化水平。α-tubulin的乙酰化水平是微管稳定性的标志,体外微管组装实验表明,FHL1抑制微管的组装。另外,FHL1过表达使得肝癌细胞HepG2对紫杉醇耐药。进一步研究发现,紫杉醇和双氧水的刺激诱导FHL1表达,FHL1通过激活p38信号通路降低微管相关蛋白Tau与微管的亲和力,抑制微管的组装,从而介导肝癌细胞对紫杉醇耐药。本研究以肿瘤治疗中重要的化疗靶标微管为突破点,首次探讨FHL1在紫杉醇耐药中发挥的功能及其机制研究,对肝癌的治疗和预后将具有重要的指导意义。

论文目录

• 英文缩写词表
• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 引物合成及序列测定
• 2.1.2 菌株与细胞株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 分子生物学试剂和化学试剂
• 2.1.5 细胞培养试剂和转染试剂
• 2.1.6 抗体
• 2.1.7 主要实验仪器
• 2.1.8 常用溶液配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒构建与鉴定
• 2.2.2 慢病毒包装及哺乳动物细胞稳定克隆的制备
• 2.2.3 哺乳动物细胞的转染
• 2.2.4 细胞全蛋白提取及蛋白浓度测定
• 2.2.5 Western blot分析
• 2.2.6 GST融合蛋白的诱导表达
• 2.2.7 GST融合蛋白的纯化
• 2.2.8 GST沉淀（pull-down）分析
• 2.2.9 免疫共沉淀IP
• 2.2.10 细胞免疫荧光
• 2.2.11 总RNA的提取
• 2.2.12 反转录PCR（RT-PCR）
• 2.2.13 Real-time PCR
• 2.2.14 细胞周期同步化方法
• 2.2.14.1 G1、S期细胞的获得
• 2.2.14.2 G2、M期细胞的获得
• 2.2.15 流式细胞仪检测细胞生长周期
• 2.2.16 细胞生长分析
• 2.2.17 划痕试验
• 2.2.18 内源性免疫共沉淀
• 3 结果与分析
• 3.1 FHL与α/β-tubulin物理互作研究
• 3.1.1 FHL1过表达及敲低稳定细胞系的建立
• 3.1.2 筛选与FHL1相互作用的蛋白
• 3.1.2.1 FHL1与α-β-tubulin在细胞外相互作用
• 3.1.2.2 FHL1与α/β-tubulin在细胞内相互作用
• 3.1.2.3 FHL1与α/β-tubulin在生理条件下相互作用
• 3.1.2.4 FHL1和α-tubulin相互作用区域的定位
• 3.2 FHL1与α-tubulin功能互作研究
• 3.2.1 FHL1不影响α/β-tubulin的表达
• 3.2.2 FHL1调节α-tubulin的乙酰化
• 3.2.3 FHL1调节α-tubulin的乙酰化不依赖于两者的相互作用
• 3.2.4 FHL家族和LMO家族都具有调节α-tubulin乙酰化的功能
• 3.2.5 FHL1通过调节α-tubulin的乙酰化调控细胞生长
• 3.2.6 FHL1通过调节α-tubulin的乙酰化调控细胞迁移
• 3.2.7 FHL1并非通过调节α-tubulin的乙酰化调控细胞周期
• 3.2.8 FHL1抑制体外微管的组装
• 3.2.9 过量表达FHL1抑制微管恢复
• 3.2.10 敲低FHL1使肝癌细胞对紫杉醇敏感
• 3.3 FHL1影响微管组装和稳定的分子机制研究
• 3.3.1 FHL1不影响α/β-tubulin二聚体的形成
• 3.3.2 FHL1不通过α-tubulin的去乙酰化酶调节α-tubulin的乙酰化
• 3.3.3 FHL1通过p38途径调节Tau的磷酸化进而调节α-tubulin的乙酰化
• 3.3.3.1 FHL1通过调节Tau的磷酸化水平调节α-tubulin的乙酰化
• 3.3.3.2 FHL1通过p38途径而不是GSK-β途径调节Tau的磷酸化
• 3.3.3.3 FHL1通过p38途径调节α-tubulin的乙酰化
• 3.3.3.4 FHL1通过MKK3-p38途径调节α-tubulin的乙酰化
• 2O₂诱导FHL1表达'>3.3.4 Taxol和H₂O₂诱导FHL1表达
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢