整合素αVβ3、αVβ5与β1类分子激活状态与肿瘤迁移关系的研究

论文摘要

恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一。由于恶性肿瘤具有浸润性生长与远处转移的能力,导致在临床上难以治愈。每年约有90%的恶性肿瘤患者死于恶性肿瘤转移和扩散。黏附分子家族成员,特别是整合素家族分子在恶性肿瘤的形成过程中起着非常重要的作用,其通过与细胞外基质的相互作用而介导肿瘤细胞的迁移及肿瘤新生血管的生成,当整合素处于激活状态时,能提高整合素与其配体的亲和力而促进肿瘤细胞与细胞外基质的黏附及迁移。本研究前期工作首次发现表达于细胞表面含有点突变的a Ⅱbβ3-Cys5Ala 、a Ⅱbβ3-Cys435Ala、a Ⅱb β3-Cys560Arg及a Ⅱbβ3-Cys583Ala不需配体诱导而呈持续的激活状态,它们介导细胞内信号传导、配体结合的能力均高于正常。上述发现提供了分子内Cys5-Cys435、Cys560-Cys583二硫键存在的功能性证据,并阐明二硫键参与a Ⅱb β3的构象调节和激活过程的分子机理。在前期工作基础上通过流式细胞术对本实验室已构建的整合素aVβ3-WT、aVβ3-Cys5Ala、aVβ3-Cys435Ala、aVβ3-Cys560Arg及aVβ3-Cys583Ala进行表达量及激活状态分析,发现整合素aVβ3-Cys5Ala、aVβ3-Cys435Ala、aVβ3-Cys560Arg及aVβ3-Cys583Ala不需配体诱导而呈持续的激活状态,且CHO-aVβ3-WT和CHO-aVβ3-Cys560Arg表达量相近。通过SCID小鼠肿瘤迁移动物模型的初步探索发现,与对照组相比,10天后,尾静脉注射CHO细胞的SCID小鼠肺部表面出现瘤结,后经组织形态学分析,肺部内部出现典型的肿瘤病灶。但此模型的各项条件有待进一步优化。为了观察在整合素其它β亚基中产生相应的突变是否也会出现类似的结果,通过对β3、β1 和β5 同源性分析,采用PCR 方法扩增了对应于β3 的第5 与435 位Cys 的β1-Cys7Ala、β1-Cys442Ala、β5-Cys5Ala 及β5-Cys440Ala 突变体片段及β1、β5 野生型片段,并构建了相应的pCDNA3.1C 表达载体。经Western Blot检测,成功实现了β1-WT、β1-Cys7Ala 及β1-Cys442Ala 在COS7 细胞中的瞬时表达。同时将aV 分别与β5 野生型及突变体共转染,经筛选后,获得了一批整合素aVβ5 野生型及其突变体的稳定细胞株,有待进一步流式细胞术及Western Blot 分析。本研究为深入研究整合素激活状态在肿瘤转移过程中的作用进而研制具有抑制活性的小鼠抗人β1、β5 及β3 单克隆抗体,在体内外检测其对肿瘤新生血管发生和肿瘤细胞转移的抑制活性提供依据,为其最终应用于治疗肿瘤奠定基础。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 恶性肿瘤
• 1.1.1 恶性肿瘤概况
• 1.1.2 恶性肿瘤的迁移过程
• 1.2 黏附分子与肿瘤
• 1.2.1 黏附分子的种类
• 1.2.2 黏附分子与肿瘤迁移
• 1.3 整合素与肿瘤迁移
• 1.3.1 整合素家族
• 1.3.2 整合素家族分子的配体
• 1.3.3 整合素与肿瘤
• 1.3.4 肿瘤转移过程中整合素的信号传导作用
• 1.3.5 整合素参与肿瘤的迁移与血管生成
• 1.3.6 整合素的构象状态与肿瘤迁移
• 1.3.7 整合素aVβ3、aVβ5 与β1 类分子与肿瘤
• 1.4 本研究的科学前提及目的意义
• 1.4.1 本研究的科学前提
• 1.4.2 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验所用菌株、细胞株及实验动物
• 2.1.2 与本论文有关的质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 标准分子量
• 2.2 方法
• 2.2.1 流式细胞术检测整合素aVβ3 野生型及其突变体在CHO 中的表达
• 2.2.2 以CHO 细胞构建SCID 小鼠肿瘤迁移动物模型
• 2.2.3 SCID 小鼠肺部的组织形态学
• 2.2.4 PCR 扩增整合素β1 和β5 突变体
• 2.2.5 PCR 片段的克隆及真核表达载体的构建
• 2.2.6 细胞的复苏
• 2.2.7 培养细胞的传代
• 2.2.8 细胞瞬时表达转染方法
• 2.2.9 稳定表达细胞株的筛选
• 2.2.10 细胞的冻存
• 2.2.11 细胞蛋白质样品的制备
• 2.2.12 细胞蛋白浓度的测定
• 2.2.13 SDS-PAGE 分析细胞表达蛋白
• 2.2.14 Western Blot 分析细胞表达蛋白
• 第三章 结果与分析
• 3.1 实验引言
• 3.2 流式细胞术分析整合素aVβ3 及突变体在CHO 细胞上的表达
• 3.2.1 整合素aVβ3 及突变体在CHO 细胞上表达量的分析
• 3.2.2 整合素aVβ3 野生型及突变体激活状态分析
• 3.3 肿瘤迁移动物模型的构建
• 3.4 整合素β1 亚基与β5 亚基突变体的构建
• 3.4.1 整合素β3、β1 与β5 亚基同源性分析
• 3.4.2 整合素β1 亚基与β5 亚基突变体的克隆策略
• 3.4.3 PCR 扩增整合素β1 亚基与β5 亚基重叠突变小片段
• 3.4.4 PCR 扩增整合素β1 亚基与β5 亚基野生型及突变全长片断
• 3.4.5 整合素β1 与β5 亚基野生型及突变体表达载体的构建
• 3.4.6 整合素β1 亚基野生型及突变体在COS7 细胞中的瞬时表达
• 3.5 整合素aVβ5 野生型及突变体CHO 稳定细胞系的构建
• 3.5.1 pEMC-3-aV 表达载体的酶切鉴定
• 3.5.2 整合素aVβ5 野生型及突变体CHO 稳定表达细胞系的构建
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介