论文摘要
烧伤治疗的一个核心问题就是创面问题,对于大面积烧伤患者而言,及时有效地覆盖创面对于提高患者的生存率至关重要。目前关于创面覆盖物组织工程皮肤的研究开展较早,主要集中于人工皮肤种子细胞研究、真皮支架才材料的研制、复合人工皮肤的构建与应用等。表皮干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞的研究目前主要集中在表皮干细胞的分离纯化、分子标志及增殖调控等方面,有众多疑问悬而未决从而制约组织工程皮肤的应用。人永生化角朊细胞株HaCaT细胞是由成人表皮细胞自发转化而来的细胞系,具有永生性和与角质形成细胞相似的增殖、分化特性,遗传特性稳定,不具有成瘤性。但是,关于HaCaT细胞具备多大程度的表皮干细胞的特征以前没有研究报道。如果其具备一定程度的干细胞特征,则可以尝试将HaCaT细胞作为种子细胞构建新型人组织工程皮肤。本研究先以HaCaT细胞为研究对象,选择几个干细胞表型和细胞凋亡作流式细胞术分析;同时以SD大鼠真皮支架应用改良的物理化学方法制备异种无细胞真皮（Acelluar dermal matrix,ADM）。在此基础之上,初步探索将人永生化角朊细胞复合异种脱细胞真皮构建新型组织工程皮肤。目的1.利用流式细胞分析技术观察CD49fCD71、角蛋白K19、CD29和CD133这几个干细胞相关表型在HaCaT细胞上的表达率和HaCaT细胞的凋亡。为以该细胞系构建人组织工程皮肤和进行基因操作提供相应的实验依据。2.改良法制作SD大鼠脱细胞真皮支架,并通过HE染色法和扫描电镜评估效果。3.尝试将种子细胞（HaCaT）和ADM（SD大鼠脱细胞真皮支架）结合构建新型人组织工程皮肤。方法1.采用无血清培养基对HaCaT细胞进行培养,获取处于对数生长期的细胞进行直接荧光双标法、直接荧光单标法和间接荧光单标法以分别CD49fCD71、角蛋白K19、CD29和CD133,依托流式细胞仪检测上述抗原在HaCaT细胞的表达情况。AnneXin V法试剂盒测HaCaT细胞凋亡。2.利用物理化学方法,采用SD大鼠网状层真皮制备异种脱细胞真皮（Acelluar dermal matrix,ADM）;HE染色法和扫描电镜观察脱细胞前后真皮效果,并照相记录。3.应用MTT比色法作生长曲线观察HaCaT细胞长满真皮支架单层所需时间。HE染色法和扫描电镜观察脱细胞前后真皮支架和细胞单层。4.扫描电镜观察接种后第一天和第五天HaCaT细胞在ADM上的生长情况。HE染色法观察HaCaT细胞在ADM上的生长第一天,第五天和第十天的生长情况。结果1.特异性较高的角朊干细胞表型CD49f+CD71-和K19+在HaCaT细胞的百分率分别为16.6±2.8%和14.94±1.23%。CD29+HaCaT细胞为49.55±6.68%,可能包括了角朊干细胞和短暂扩增细胞。分别反映细胞黏附特性和增殖能力的CD49f+HaCaT细胞和CD71+HaCaT细胞各占98.1±0.8%和82.1±3.9%。HaCaT细胞仅表达3.43±0.77%的干细胞表型CD133。HaCaT细胞的凋亡比例为4.9±2.9%.2.脱细胞真皮的细胞成分消失,组织疏松,网状层真皮有许多天然微孔存在,有利于接种到ADM上细胞的存活,为理想的组织皮肤支架;3.将HaCaT细胞按2x105/cm2密度接种到ADM上,接种一天后,活力较强的细胞伸出伪足紧密粘附于真皮表面;根据MTT法,HE染色法和扫描电镜的观察,5天后细胞长满ADM形成单层细胞膜片。4. HE染色法观察相同条件下接种细胞后十天气液相培养初步形成的细胞多层。结论1.人永生化角朊细胞系HaCaT细胞的表型特征表明它具有较高的角朊干细胞和短暂扩增细胞比例以及很强的黏附基底膜特性和增殖能力,提示它可以作为构建人组织工程皮肤种子细胞和基因修饰角朊干细胞的替代物。2.改良法制作SD大鼠脱细胞真皮效果满意,可以作为本研究的理想真皮支架。3.在SD大鼠脱细胞真皮支架上以HaCaT细胞为种子细胞可以初步构建新型人组织工程皮肤。
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标签：人永生化角朊细胞论文; 干细胞表型论文; 流式细胞术论文; 组织工程皮肤论文; 异种脱细胞真皮论文; 基因修饰论文;