利用整体胚胎原位杂交技术分析pop3对斑马鱼心脏环化的影响

论文摘要

心脏环化是心脏发育过程的重要阶段,心脏环化正常与否和心脏功能密切相关,其过程涉及到一系列相关基因在时空上的精确表达。本实验室前期研究发现pop3在斑马鱼的心脏和肌肉中都有高水平表达,通过morpholinos反义核苷酸敲减技术发现pop3可能与心脏发育相关,并通过免疫沉淀等方法获得一个与POP3存在相互作用的蛋白ATF4。本研究以斑马鱼为模型,利用整体胚胎原位杂交技术分析pop3和atf4基因的表达变化对心脏环化的影响。为了研究pop3基因引起的心脏环化表型变化,我们制备了五个心脏标记基因nppa、cmlc2、vmhc、amhc和bmp4探针进行整体胚胎原位杂交分析,分别观察敲低pop3的表达、过表达pop3和拯救pop3的突变表型后的心脏环化表型变化。在野生型胚胎中,nppa和cmlc2在整个心脏中特异性表达,vmhc在胚胎心室表达,而amhc在胚胎心房表达,bmp4则主要在胚胎心脏瓣膜中表达。在pop3 morpholino干扰型胚胎中,敲低pop3的表达导致nppa基因在心脏中的表达量下降,48hpf时期其胚胎心脏呈线性化；敲低pop3的表达导致表达cmlc2基因的心脏前体细胞的数目减少,48hpf时期其胚胎心脏呈线性化；同时,敲低pop3的表达导致21体节期表达vmhc的心室前体细胞减小,vmhc基因的表达水平降低,24hpf和48hpf时期胚胎的心室大小都有不同程度的减小,48hpf时期心室减小最为明显,胚胎的心房大小也变小；bmp4的表达在敲低pop3的表达时其强度减弱,心脏瓣膜变小。与敲低pop3的表达导致的心脏突变表型相反,过表达pop3基因时,nppa基因在心脏中的表达量呈上升趋势,胚胎心脏腔室也有增大的趋势,而cmlc2型心脏前体细胞的数目增多,胚胎心脏腔室也有增大的趋势；过表达pop3基因时,vmhc和amhc基因的表达量上升,vmhc型心室前体细胞的数目增加,24hpf和48hpf时期的心室大小都有不同程度的增大,心房则只有略微增大；bmp4在pop3基因过表达时其表达强度明显增强,心脏瓣膜显著增大。在用pop3 mRNA拯救morpholino干扰后的胚胎中,大部分胚胎的心脏表型得以恢复,与野生型胚胎无明显差异,上述五个标记基因的表达水平与野生型胚胎差异不大。同样选用了上述五个心脏标记基因来研究atf4基因对心脏环化的影响,实验结果显示：敲低atf4达也导致心脏腔室和心脏瓣膜的大小缩小,心室、心房的发育不全,心脏环化缺陷的表型,同时引起上述五个心脏标记基因表达量和表达范围的下降；atf4 mRNA过表达则使胚胎的心脏腔室表现出增大的趋势,并且标记基因的表达量也有所上升；用atf4的mRNA拯救morpholinos干扰后的胚胎,大部分心脏表型与野生型胚胎无明显差异,并且上述五个标记基因的表达量也趋于正常。上述五个心脏标记基因的斑马鱼整体胚胎原位杂交实验结果表明,pop3和atf4的表达变化能够导致斑马鱼心脏环化异常,pop和atf4协同控斑马鱼的心脏环化过程,同时pop3和atf4可能是nppa、cmlc2、vmhc、amhc和bmp4基因的上游调控基因,通过调控它们的表达而参与心脏发育过程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 斑马鱼及心脏发育简介
• 1.2 心脏环化
• 1.3 POP3和ATF4相关研究背景
• 1.4 相关标记基因
• 1.4.1 nppa（natriuretic peptide precursorA）
• 1.4.2 myl7（myosin light polypeptide 7）
• 1.4.3 vmhc（ventricular-specific myosin heavy chain gene）
• 1.4.4 myh6（myosin,heavy polypeptide 6,cardiac muscle,alpha）
• 1.4.5 bmp4（bone morphogenetic protein-4）
• 1.5 本文研究意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 其它试剂
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒的小量制备与鉴定
• 2.2.2 地高辛标记的RNA探针的合成
• 2.2.3 斑马鱼的培养
• 2.2.4 斑马鱼整体胚胎原位杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 斑马鱼心脏标记基因探针的制备
• 3.1.1 nppa探针合成的结果
• 3.1.2 cmlc2探针合成的结果
• 3.1.3 vmhc探针合成的结果
• 3.1.4 amhc探针合成的结果
• 3.1.5 bmp4探针合成的结果
• 3.2 斑马鱼POP3基因表达变化引起心脏环化缺陷表型
• 3.2.1 nppa基因的原位杂交结果
• 3.2.2 cmlc2基因的原位杂交结果
• 3.2.3 vmhc基因的原位杂交结果
• 3.2.4 amhc基因的原位杂交结果
• 3.2.5 bmp4基因的原位杂交结果
• 3.3 ATF4基因表达变化引起斑马鱼心脏环化缺陷表型
• 3.3.1 nppa的表达差异
• 3.3.2 cmlc2的表达差异
• 3.3.3 vmhc的表达差异
• 3.3.4 amhc的表达差异
• 3.3.5 bmp4的表达差异
• 4 讨论
• 结语
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢