动点HsMis12复合物分子构架解析及相互作用调控网络研究

论文摘要

细胞周期是细胞最基本的生命活动之一,它通过一系列有序的反应进行分裂,产生两个包含相同遗传物质的子细胞。细胞周期中最核心的事件就是进行遗传物质的复制和分离,即在S期进行DNA的复制,然后在有丝分裂时期将复制的染色体平均分配到子细胞中去。有丝分裂过程中染色体的运动和分离又是通过纺锤体微管和位于染色体着丝粒上的动点之间的协同作用来完成的。Mis12复合物是一个进化上较为保守的蛋白复合物,人源Mis12复合物由Mis13、Mis14、Mis12和PMF1四个蛋白组成,功能性研究表明它们在动点的组装和染色体的分离中发挥重要作用,但是它们动点定位机制仍不清楚。在我们进行的Far western筛选中,我们发现Mis13是有丝分裂过程中重要激酶Aurora-B的一个潜在的结合蛋白。在有丝分裂的前期、前中期和中期阶段,Mis13和Aurora-B激酶具有相同的着丝粒定位。进一步的实验表明Mis13不仅可以在体内外同Aurora-B激酶发生相互作用,而且还可以被Aurora-B激酶磷酸化,Aurora-B激酶可以磷酸化Mis13第100位和第109位丝氨酸残基。在细胞内,无论是用干扰RNA抑制Aurora-B蛋白的表达还是用小分子抑制剂来抑制Aurora-B的激酶活性,都会使Mis13的动点定位明显减少,但是却不会影响Mis12的动点定位,表明Aurora-B激酶特异性的决定Mis13的动点定位。此外,外源性表达Mis13不可被磷酸化突变体也不能定位到动点上,相反,模拟磷酸化的突变体却可以定位到动点,说明Aurora-B激酶介导的磷酸化作用直接决定了Mis13的动点定位。此外,Mis13的动点定位还受到Aurora-B激酶的时空调节,在有丝分裂的晚期阶段,Aurora-B激酶活性下降,Mis13会从动点上解离下来。先前的研究表明下调Aurora-B蛋白的表达或是抑制Aurora-B激酶活性会破坏外层动点蛋白Ndc80复合物和马达蛋白CENP-E的动点定位,但是这一机制仍不清楚。我们的RNA沉默实验表明敲除掉Mis13蛋白会减少Ndc80复合物和CENP-E的动点定位,因此,Aurora-B激酶对Mis13的磷酸化调节可能在这一通路中发挥作用。有意思的是,在抑制掉Aurora-B激酶活性的细胞中,外源性转入Mis13的模拟磷酸化突变体可以在很大程度上恢复Nuf2和CENP-E的动点定位,进而修复动点-微管之间的连接,这些结果表明Aurora-B激酶对Mis13的磷酸化修饰在外层动点蛋白的装配和动点一微管之间的连接中发挥作用。Mis12复合物在动点上的功能已经较为清楚,但是它们分子间结合方式仍是未知的,为了解析Mis12复合物的分子构架,我们引入了共表达系统在体外表达和重组该复合物。共纯化结果显示Mis13能和Mis14结合形成一个相对紧密的异二聚体,PMF1与Mis12之间通过微弱的作用相结合。此外,这两个异二聚体之间也是依靠微弱的作用而结合,但是,一旦这两个异二聚体结合在一起,它们又能协同作用最终形成一个分子比近乎1:1:1:1的四蛋白复合物,我们的酵母双杂交实验进一步证实了这一结论。此外,Mis12复合物也能够和Ndc80复合物中的Spc24-Spc25异二聚体以及KNL-1蛋白的C端发生直接结合,因此我们推论人中的Mis12复合物也具有同Ndc80复合物、KNL-1蛋白结合形成KMN复合物的能力。除了能形成KMN复合物之外,Mis12复合物还通过Mis13和Mis12蛋白同外层动点蛋白Zwint-1相结合,除此之外,Mis13蛋白还能特异的与CENP-H/CENP-I复合物中的CENP-H相结合,但是却不会同该复合物中的另外一个组份CENP-50相结合,说明Mis13和Mis12蛋白主要介导Mis12复合物同其他动点蛋白之间的结合。综上所述,我们认为Aurora-B激酶对Mis13的磷酸化作用促使Mis13在动点上聚集,从而形成一个完整的Mis12复合物。而一旦Mis12复合物形成,它又会同Ndc80复合物、KNL-1蛋白结合形成KMN复合物,组装出有效的动点-微管结合表面;此外,它们还会募集马达蛋白CENP-E等到动点上,实现染色体的运动和分离。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 动点的超微结构
• 1.3 动点复合物
• 1.3.1 CENP-A及NAC/CAD复合物
• 1.3.2 染色体旅客蛋白复合物
• 1.3.3 NDC80复合物
• 1.3.4 Mis12复合物
• 1.3.5 KMN复合物
• 1.3.6 RZZ复合物
• 1.3.7 MCC复合物
• 1.4 动点上的蛋白激酶
• 1.4.1 Aurora-B激酶
• 1.4.2 PLK1激酶
• 1.4.3 TTK激酶
• 1.4.4 NEK2A激酶
• 1.5 动点-微管的黏附和运动
• 1.6 参考文献
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第三章 结果和讨论
• 3.1 Aurora-B激酶对Mis13磷酸化作用分析及在动点组装中的功能解析
• 3.1.1 Mis13蛋白是Aurora-B激酶一个新的作用底物
• 3.1.2 Aurora-B激酶活性决定Mis13在动点上的定位
• 3.1.3 Aurora-B激酶介导的磷酸化作用直接决定Mis13同动点的结合
• 3.1.4 Aurora-B激酶决定Mis13在动点上的定位是周期依赖性的
• 3.1.5 Aurora-B激酶对Mis13的磷酸化作用调节了动点的组装
• 3.1.6 Aurora-B激酶对Mis13的磷酸化作用稳定了动点-微管之间的连接
• 3.1.7 讨论
• 3.2 Mis12复合物分子构架解析以及与其他动点蛋白相互作用研究
• 3.2.1 共表达载体的构建
• 3.2.2 Mis12复合物是由两个柔性的异二聚体结合形成的四蛋白复合物
• 3.2.3 Mis12复合物以1:1:1:1的分子比结合
• 3.2.4 人源Mis12复合物也能和NDC80复合物、KNL-1蛋白一起形成KMN复合物
• 3.2.5 Mis12和Mis13介导Mis12复合物同其它动点蛋白之间的结合
• 3.2.6 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录