鸭瘟病毒gC基因部分特征分析及gC基因疫苗诱导鸭免疫发生的研究

论文摘要

论文对本实验室注册的DPV gC基因（GenBank登录号EU076811）开展下列研究：病毒体外感染宿主鸭胚成纤维细胞gC基因的转录和表达时相分析及亚细胞定位检测；DPVgC基因疫苗诱导实验鸭细胞免疫和体液免疫的研究。获得以下结果：鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞gC基因的转录时相分析应用荧光定量PCR方法对DPV感染鸭胚成纤维细胞（DEF）后病毒gC基因mRNA表达水平的变化进行了动态检测,结果表明,最早可在DPV感染宿主细胞后1h检测到该基因转录产物,随着感染时间的延长,转录产物量逐渐增加,并于感染后28-36h达到转录峰值,随后转录产物量逐渐下降,但在72h仍保持较高水平。根据转录谱推测DPVgC基因可能属晚期基因。鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞gC基因的表达时相分析应用Western Blot方法对DPV感染DEF后病毒gC蛋白的表达水平变化进行了动态检测。在感染后4-72h的细胞蛋白提取物中均可观察到与DPV gC蛋白预测大小相一致的条带。4h时,在约45kDa的位置目的条带隐约可见,从16h起逐渐变大变清晰，48h左右达到最大值。综合分析DPVgC基因的转录表达时相模式,其在感染晚期得到大量表达,推测该基因为病毒的晚期基因。鸭瘟病毒gC基因产物在鸭胚成纤维细胞中的亚细胞定位应用间接免疫荧光对DPV感染DEF中gC基因的表达进行亚细胞定位检测,结果表明,特异性荧光最早可在感染后4h检测到,这时细胞质内荧光的量相对较少,随感染时间延长,荧光强度逐渐增强,且大量聚集在细胞质的近核区域,随后荧光强度减弱,在感染60h后基本消失。根据gC基因表达产物的这种分布特征,可初步推测为病毒基因组中的gC基因在宿主DEF的细胞质中完成gC蛋白的合成,合成的gC蛋白参与后期病毒的组装和成熟过程。鸭瘟病毒gC基因疫苗诱导实验鸭细胞免疫的研究鸭瘟病毒gC基因疫苗（pcDNA-DPV-gC）以不同途径和不同剂量免疫实验鸭,以生理盐水、空载质粒pcDNA3.1 （+）和鸭瘟弱毒疫苗为对照,采用淋巴细胞增殖试验（MTT法）和流式细胞仪（FACS）分析法,分别对鸭外周血中T淋巴细胞的转化功能、CD4+和CD8+T淋巴细胞数进行了检测。结果表明,pcDNA-DPV-gC基因疫苗接种实验鸭后外周血T淋巴细胞对ConA的反应性有明显增强,CD4+和CD8+T淋巴细胞数也显著高于对照组,在免疫后第3d,基因疫苗免疫组与对照组比较差异显著（P<0.05）,且在免疫后5d-7d达到最大值。比较不同免疫途径,基因枪途径诱导鸭外周血T淋巴细胞增殖、CD4+和CD8+T淋巴细胞免疫应答优于肌肉注射途径；比较不同免疫剂量,基因枪和肌肉注射途径均存在一定的剂量相关性,以基因枪6μg和肌肉注射200μg诱导细胞免疫应答的能力较强。鸭瘟病毒gC基因疫苗诱导实验鸭体液免疫的研究采用间接ELISA和中和试验分别对实验鸭血清中特异性血清IgG抗体和中和抗体动态变化进行了检测。结果表明,不同途径基因疫苗接种实验鸭后均能诱导产生DPV特异性血清抗体和中和抗体,基因枪和肌肉注射各组间无明显差异,而弱毒对照组在各采样时间点均较基因枪和肌肉注射各组高。以上结果表明,制备的pcDNA-DPV-gC基因疫苗免疫鸭后能够诱导机体产生良好的体液和细胞免疫应答,基因枪免疫较肌肉注射更能诱导细胞免疫应答的产生。与弱毒疫苗相比,pcDNA-DPV-gC基因疫苗诱导细胞免疫应答的能力优于DPV弱毒疫苗,而DPV弱毒疫苗诱导体液免疫的能力更强。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述及选题目的
• 第一章 疱疹病毒gC基因及其编码蛋白的研究进展
• 1 疱疹病毒gC基因及gC蛋白的特点
• 1.1 gC基因特点
• 1.2 gC基因编码蛋白特点
• 2 gC蛋白的功能
• 2.1 gC介导病毒吸附细胞
• 2.2 gC的补体调节特性
• 2.3 gC与病毒毒力
• 3 gC蛋白的免疫原性及DNA疫苗策略的应用
• 3.1 gC蛋白与病毒免疫
• 3.2 基于gC基因的DNA疫苗研究
• 4 展望
• 5 选题目的
• 第二部分 试验研究
• 第二章 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞gC基因转录时相分析
• 1 试验材料
• 1.1 毒株
• 1.2 试验动物
• 1.3 主要试验仪器
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要溶液配制
• 1.5.1 琼脂糖凝胶电泳相关溶液
• 1.5.2 制备鸭胚成纤维细胞相关溶液
• 1.5.3 其他
• 2 试验方法
• 2.1 鸭胚成纤维细胞的制备和病毒感染
• 2.2 总RNA的提取
• 2.3 RNA完整性及纯度分析
• 2.4 cDNA合成
• 2.5 引物设计与合成
• 2.6 引物的特异性检测
• 2.7 标准品的制备
• 2.8 FQ-PCR标准曲线的制作
• 2.9 样品的定量检测
• 2.10 FQ-PCR结果分析
• 3 结果
• 3.1 RNA完整性及纯度分析
• 3.2 引物验证
• 3.3 FQ-PCR标准曲线的制作
• 3.3.1 gC基因标准曲线的制作
• 3.3.2 β-actin基因FQ-PCR标准曲线的制作
• 3.3.3 FQ-PCR对DPV gC基因的定量检测
• 3.3.4 FQ-PCR数据统计分析
• 4 讨论
• 4.1 荧光定量PCR技术
• 4.2 DPV gC基因的转录谱特征
• 第三章 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞gC基因表达时相分析
• 1 试验材料
• 1.1 毒株
• 1.2 试验动物
• 1.3 主要试验仪器
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要溶液配制
• 1.5.1 SDS-PAGE电泳溶液
• 1.5.2 Westem Blot相关溶液
• 1.5.3 细胞蛋白提取溶液
• 1.5.4 制备鸭胚成纤维细胞相关溶液
• 2 试验方法
• 2.1 鸭胚成纤维细胞的制备与病毒感染
• 2.2 细胞蛋白的提取
• 2.3 SDS-PAGE
• 2.4 Western Blot检测
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 Western Blot技术
• 4.2 DPV gC基因表达谱特征
• 第四章 鸭瘟病毒gC基因产物的亚细胞定位分析
• 1 试验材料
• 1.1 毒株
• 1.2 细胞
• 1.3 主要试验仪器
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要溶液配制
• 2 试验方法
• 2.1 间接免疫荧光（IFA）检测DPV gC基因产物亚细胞定位方法的建立及条件优化
• 2.1.1 IFA检测DPV gC基因产物亚细胞定位方法的建立
• 2.1.2 条件优化
• 2.1.3 特异性检测
• 2.1.4 结果判定
• 2.2 DPV gC基因产物亚细胞定位检测
• 3 结果
• 3.1 IFA检测DPV gC基因产物亚细胞定位方法的建立及条件优化
• 3.1.1 条件优化结果
• 3.1.2 特异性试验
• 3.2 DPV gC基因产物亚细胞定位检测
• 4 讨论
• 4.1 关于蛋白定位研究方法
• 4.2 DPV gC在宿主亚细胞中的定位分析
• 第五章 鸭瘟病毒gC基因疫苗诱导实验鸭免疫发生的研究
• 1 试验材料
• 1.1 毒株/质粒/疫苗
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要试验仪器
• 1.4 主要试剂
• 1.5 试剂的配制
• 1.5.1 MTT相关试剂
• 1.5.2 ELISA相关试剂
• 2 试验方法
• 2.1 基因枪"子弹"的准备
• 2.2 动物分组和免疫
• 2.3 血样的采集
• 2.4 T淋巴细胞转化试验
• +、CD8⁺T淋巴细胞亚群数量的检测'>2.5 CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞亚群数量的检测
• 2.6 血清抗体水平的检测
• 2.6.1 ELISA抗原的制备
• 2.6.2 酶标抗体工作浓度的确定
• 2.6.3 抗原最适包被浓度和样本最佳稀释度的选择
• 2.6.4 间接ELISA基本操作程序
• 2.7 中和抗体水平的检测
• 2.7.1 细胞培养半数感染量（TCID50）的测定
• 2.7.2 中和试验
• 3 结果
• 3.1 pcDNA-DPV-gC以不同途径、不同剂量免疫与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血T淋巴细胞转化效果
• 3.1.1 不同剂量pcDNA-DPV-gC基因枪轰击与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血T淋巴细胞转化效果
• 3.1.2 不同剂量pcDNA-DPV-gC肌肉注射与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血T淋巴细胞转化效果
• 3.1.3 不同途径免疫pcDNA-DPV-gC后鸭外周血T淋巴细胞转化效果
• +、CD8⁺T淋巴细胞数量变化'>3.2 pcDNA-DPV-gC以不同途径、不同剂量免疫与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量变化
• +、CD8⁺T淋巴细胞数量的变化'>3.2.1 不同剂量pcDNA-DPV-gC基因枪轰击与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量的变化
• +T淋巴细胞数量的变化'>3.2.1.1 不同剂量pcDNA-DPV-gC基因枪轰击与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD4⁺T淋巴细胞数量的变化
• +T淋巴细胞数量的变化'>3.2.1.2 不同剂量pcDNA-DPV-gC基因枪轰击与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD8⁺T淋巴细胞数量的变化
• +、CD8⁺T淋巴细胞数量的变化'>3.2.2 不同剂量pcDNA-DPV-gC肌肉注射与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量的变化
• +T淋巴细胞数量的变化'>3.2.2.1 不同剂量pcDNA-DPV-gC肌肉注射与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD4⁺T淋巴细胞数量的变化
• +T淋巴细胞数量的变化'>3.2.2.2 不同剂量pcDNA-DPV-gC肌肉注射与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD8⁺T淋巴细胞数量的变化
• +、CD8⁺T淋巴细胞数量的变化'>3.2.3 不同途径免疫pcDNA-DPV-gC后鸭外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量的变化
• +T淋巴细胞数量变化'>3.2.3.1 不同途径免疫pcDNA-DPV-gC和DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD4⁺T淋巴细胞数量变化
• +T淋巴细胞数量变化'>3.2.3.2 不同途径免疫pcDNA-DPV-gC与DPV弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD8⁺T淋巴细胞数量变化
• 3.3 pcDNA-DPV-gC以不同途径、不同剂量免疫与DPV弱毒疫苗免疫后鸭血清抗体水平变化
• 3.3.1 不同剂量pcDNA-DPV-gC基因枪轰击与DPV弱毒疫苗免疫后鸭血清抗体水平的变化
• 3.3.2 肌肉注射不同剂量pcDNA-DPV-gC与DPV弱毒疫苗免疫后鸭血清抗体水平的变化
• 3.3.3 不同途径免疫pcDNA-DPV-gC后鸭血清抗体水平的变化
• 3.4 pcDNA-DPV-gC以不同途径、不同剂量免疫与DPV弱毒疫苗免疫后鸭血清中和抗体水平变化
• 50的测定'>3.4.1 鸭瘟细胞毒TCID₅₀的测定
• 3.4.2 不同剂量pcDNA-DPV-gC基因枪注射、肌肉注射和DPV弱毒疫苗免疫后鸭血清中和抗体水平的变化
• 4 讨论
• 4.1 基于gC的基因疫苗应用
• 4.2 基因疫苗和弱毒疫苗免疫后鸭外周血T淋巴细胞转化效果
• +和CD8⁺T淋巴细胞动态变化'>4.3 基因疫苗和弱毒疫苗免疫后鸭外周血CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞动态变化
• 4.4 基因疫苗和弱毒疫苗免疫后鸭血清抗体IgG的动态变化
• 4.5 基因疫苗和弱毒疫苗免疫后鸭血清中和抗体的动态变化
• 4.6 不同免疫途径对pcDNA-DPV-gC免疫效果的影响
• 4.7 不同免疫剂量对pcDNA-DPV-gC免疫效果的影响
• 第三部分 结论
• 附表
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况