毛头鬼伞菌丝体多糖的分离、纯化和化学结构鉴定及生物活性研究

论文摘要

毛头鬼伞[Coprinus comatus（Mueller．ex Fr．）S．F．Gray]，俗称鸡腿菇、鸡腿蘑，是一种食、药用真菌，其肉质细嫩，鲜美可口，色香味俱全。药用味甘滑，性平，有益脾胃，清心安神，治痔等功效。据文献报道，毛头鬼伞主要具有降血糖、降血脂、增强免疫、抗肿瘤、抑菌等作用。目前关于毛头鬼伞的研究，大多集中在其栽培技术和营养成分方向的研究，而对于毛头鬼伞多糖的提取、分离纯化和组成，以及生物活性作用探讨等方面还报道不多，特别是均一多糖的结构鉴定和生物活性研究还未见报道；同时，获得食药用菌多糖的途径有两种，一种是从子实体中提取，一种是从发酵产物中获取。采用深层发酵培养毛头鬼伞菌丝体，生产周期缩短，且生产工艺简便，材料易得，生产成本大幅下降，因此利用液态深层发酵是开发毛头鬼伞活性成分的一条有效途径。为了系统的研究毛头鬼伞菌丝体多糖的化学结构和生物活性，本研究对毛头鬼伞菌丝体进行了深层发酵，并对其菌丝体多糖进行了提取、分离纯化、结构鉴定和免疫活性研究。本论文共有四个部分，分别从菌丝体的深层发酵、多糖分离、纯化和理化性质、结构鉴定和免疫活性进行了研究。主要结果如下：1毛头鬼伞菌丝体的深层发酵研究本章比较了毛头鬼伞正常（CN）菌丝体和太空种（CS）菌丝体的生长势和生长代谢曲线，CN菌丝体生长势、多糖总量和生物量均优于CS菌丝体，它们的生长代谢曲线基本相似，因此，选择CN进行全面的研究。在3 L发酵罐中，转速在120～180rpm，通气量在1.2～2.4 L／min范围内，以菌丝体生物量和胞内多糖产量为指标时，转速为180rpm，通气量为2.4L／min是最优的转速和通气量。在30L发酵罐中，培养条件为：26℃，工作体积为2／3，10％的接种量，在0～24h中，转速为150rpm，通气量为10L／min；在24～96h中，转速为200rpm，通气量为20L／min，发酵4天。发酵5个批次，菌丝体生物量最高达17.26g／L。2毛头鬼伞菌丝体多糖分离纯化和理化性质研究毛头鬼伞菌丝体经95％乙醇脱脂后，依次经过沸水、碱液提取，得到水提粗多糖C30、C60、C80、C80s和碱提水溶性多糖CAP五个组分。毛头鬼伞菌丝体水提多糖的总得率（包括C30、C60和C80）为15.6％，要比子实体（6.5％）高2.4倍。通过单糖组成分析结果表明，毛头鬼伞菌丝体多糖主要由Glc、Gal、Fuc组成。C30、C60、C80组分经离子柱（DEAE-Sepharose Fast Flow）和凝胶柱（Sephacryl S100～500填料）层析分离纯化，共得到14个多糖，通过高效液相色谱检测为均一多糖。3毛头鬼伞菌丝体三种均一多糖的结构鉴定通过糖组成分析、甲基化分析、IR和NMR谱(一维：1H NMR谱，13C NMR谱，二维：COSY谱，TOCSY谱，HMQC谱，HMBC谱和NOESY谱)等方法，研究了其中3种均一多糖C30-FA3、C60-FA1和C60-FB1的化学结构。①C30-FA3的结构分析均一多糖C30-FA3的分子量为1．.3×104Da，糖组成为Fuc：Gal=1：4.02。C30-FA3甲基化分析结果表明，岩藻糖以端基方式连接，半乳糖主要以1，6-和1，2，6-两种方式连接，三个主要的连接方式的摩尔比为1.15：2.88：1。由NMR进一步分析结果表明，C30-FA3主要由（1，6）-α-D-Galp糖残基构成主链，在O-2位被α-L-Fucp糖残基取代的五个单糖残基组成的结构重复单元。C30-FA3的主要结构重复单元为：②C60-FA1的结构分析均一多糖C60-FA1的分子量为1.03×104Da，糖组成为Fuc：Gal：Glc=1：3.04：0.53。C60-FA1甲基化分析结果表明，岩藻糖以端基方式连接，半乳糖主要以1，6-和1，2，6-两种方式连接，三个主要的连接方式的摩尔比为1：2.04：0.91，含有少量1，4-和1，6-连接方式的葡萄糖。由NMR进一步分析结果表明，C60-FA1主要由（1，6）-α-D-Galp糖残基构成主链，在O-2位被α-L-Fucp糖残基取代的四个单糖残基组成的结构重复单元。C60-FA1的主要结构重复单元为：③C60-FB1的结构分析均一多糖C60-FB1的分子量为16.69×104Da，糖组成为Glc，是非淀粉类新葡聚糖。C60-FB1甲基化分析结果表明，葡萄糖以1，4-方式连接，少量葡萄糖以端基方式连接。C60-FB1的主要结构重复单元为：4)-α-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-(1→可能以自由卷曲结构存在。4毛头鬼伞菌丝体多糖的体外免疫活性研究对分离纯化过程中的各多糖组分和最终获得的均一多糖进行体外免疫活性试验，结果发现C30、C60、C80三种粗多糖对淋巴细胞均有刺激淋巴细胞增殖作用，且三者的增殖作用相当，对淋巴细胞的增殖率依次递减；C80s、CAP对淋巴细胞无增殖作用或增殖作用不大。粗多糖C30、C60、C80经离子柱分离后，盐相各组分对淋巴细胞的增殖作用均要高于水相部分。经多步凝胶柱纯化最终得到的均一多糖中C30-FB1、C30-FB2、C60-FB2、C60-FB3、C80-FA2、C80-FB1、C80-FB2在一定浓度下均具有一定的免疫活性，C30-FA2、C60-FA1有轻微刺激淋巴细胞增殖作用，C30-FA3、C60-FA2、C60-FB1、C80-FA1刺激淋巴细胞无增殖作用。菌丝体纯化出的C30-FA1（非均一）以及均一多糖C30-FA2、C30-FA3的体外免疫活性与子实体的结果是相似的。这些结果表明，利用液态深层发酵是开发毛头鬼伞活性成分多糖是可行的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 名词缩写
• 第一章 文献综述
• 第一节 毛头鬼伞的研究概况
• 1 毛头鬼伞的生物学特性
• 2 毛头鬼伞的营养成分
• 3 毛头鬼伞的药用价值
• 4 毛头鬼伞的发展前景
• 第二节 食药用菌液体发酵的特点
• 1 食药用菌液体发酵概况
• 2 食药用菌液体发酵的次生代谢产物
• 3 食药用菌液体发酵的特点
• 4 结论和展望
• 第三节 真菌多糖的研究概况
• 1 多糖的来源
• 2 真菌多糖的化学组成及结构
• 3 真菌多糖的生物功效
• 4 多糖的构效关系
• 5 真菌多糖前景
• 第四节 多糖的研究方法
• 1 多糖的分离纯化
• 2 多糖的测定
• 3 多糖结构分析
• 第五节 本课题研究的目的意义与主要内容
• 第二章 毛头鬼伞菌丝体的深层发酵
• 第一节 材料和方法
• 1 材料
• 2 方法
• 第二节 结果与分析
• 1 毛头鬼伞正常菌丝体与太空种的比较
• 2 毛头鬼伞菌丝体发酵罐（3L）条件的初筛
• 3 毛头鬼伞菌丝体发酵罐（30L）发酵代谢动力学曲线
• 第三节 小结
• 第三章 毛头鬼伞菌丝体多糖的分离纯化
• 第一节 材料和方法
• 1 材料
• 2 方法
• 第二节 结果与分析
• 1 毛头鬼伞菌丝体粗提物的制备
• 2 粗多糖的离子柱层析结果
• 3 多糖的凝胶柱层析结果
• 4 多糖纯度鉴定
• 第三节 小结
• 第四章 毛头鬼伞菌丝体均一多糖的结构分析
• 第一节 材料和方法
• 1 材料
• 2 方法
• 第二节 结果与分析
• 1 C30-FA3的结构解析
• 2 C60-FA1结构解析
• 3 C60-FB1结构解析
• 第三节 小结
• 第五章 毛头鬼伞菌丝体多糖的体外免疫活性研究
• 第一节 材料和方法
• 1 材料
• 2 方法
• 第二节 结果与分析
• 1 毛头鬼伞菌丝体粗多糖对淋巴细胞的刺激试验结果
• 2 毛头鬼伞菌丝体均一多糖对淋巴细胞的刺激试验结果
• 第三节 小结
• 第六章 讨论和全文总结
• 第一节 讨论
• 一 毛头鬼伞菌丝体的深层发酵研究
• 二 毛头鬼伞菌丝体多糖分离纯化和理化性质研究
• 三 毛头鬼伞菌丝体三种均一多糖的结构分析
• 四 毛头鬼伞菌丝体多糖的体外免疫活性研究
• 第二节 全文总结
• 一 毛头鬼伞菌丝体的深层发酵研究
• 二 毛头鬼伞菌丝体多糖分离纯化和理化性质研究
• 三 毛头鬼伞菌丝体三种均一多糖的结构分析
• 四 毛头鬼伞菌丝体多糖的体外免疫活性研究
• 第三节 本论文创新点
• 参考文献
• 附录
• 附录一 试验仪器
• 附录二 附图
• 致谢
• 发表文章