甲氨蝶呤生物素化壳聚糖纳米粒的研究

论文摘要

癌症目前仍是人类健康的第一大杀手,目前对它的治疗仍然是以化学治疗为主。然而,化疗药物在杀死癌症细胞的同时也对周围的正常细胞有很大的杀伤力,副作用很大,给癌症病人带来了极大的痛苦。近年来,由于广大医药工作者的努力,靶向制剂得到了迅速的发展,但目前的研究大部分只是局限于靶向到癌变组织,不能达到理想效果,无法分辨出癌变细胞和正常细胞。Budavari发现肿瘤细胞中维生素H（Biotin,生物素）的含量明显高于正常组织,肿瘤细胞的快速增殖需要更多的生物素。本课题用生物素化壳聚糖制备为药物载体,以抗肿瘤药甲氨蝶呤（MTX）为模型药,制备纳米粒以期达到对肿瘤细胞靶向和降低副作用的目的。本文选用壳聚糖和生物素为原料,以4-二甲基氨基吡啶（DMAP）和二环己基碳酰胺（DCC）为催化剂,在DMSO中反应制备生物素化壳聚糖（B-CS）,采用透析法进行精制。对合成中的影响因素进行了考察,用UV、FT-IR、1H-NMR和DSC对合成的产物进行了表征。结果表明了二者之间通过生成酰胺键已成功地连接在一起。采用透析法制备了MTX-B-CS-NP,采用单因素考察方法对透析法制备纳米粒的工艺进行了考察,确立了较佳的制备工艺。用微粒粒度测定仪对所制备的纳米粒进行了粒径和Zeta电位的测定,建立了高效液相色谱法分析MTX的含量,测定了载药量。并对制剂在40℃下的稳定性和体外释放度进行了研究。结果粒径为:167.4±41.34 nm,Zeta电位为+29.3mV。稳定性实验结果表明,该产品在40℃放置6个月稳定性良好。体外释放度实验结果表明该载体对甲氨蝶呤的释放具有缓释作用。由MTX-B-CS-NP的安全性试验证实纳米粒制剂无溶血性,适用于静脉注射,无注射给药部位和血管刺激性和无过敏性。对人实体瘤癌H22、HeLa、MCF-7、A375-S2和SGC-7901细胞均有不同程度的增殖抑制作用。当样品药物浓度低于50μg/mL时,样品与对照注射剂的细胞增殖抑制率较为相近,当样品药物浓度高于50μg/ml时,样品的抑制率增加较为明显,当药物浓度为100μg/mL时,样品与对照注射剂的抑制率有明显差别,分别为50.44%(H22)、49.45%（SGC-7901）、11.27%（A375-S2）、46.48%（MCF-7）和31.85%（HeLa）,样品呈现了一定的剂量依赖性,而对照注射剂各浓度间抑制率差别不大。体内抑瘤选用抑瘤率有明显差异的人实体瘤癌H22细胞。实验表明:纳米粒制剂2.5 mg/kg剂量的抑瘤率与对照注射剂5.0 mg/kg给药剂量的抑瘤率基本相当,纳米粒给药剂量为5.0mg/kg时,其体内抑瘤率远大于对照注射剂5.0 mg/kg的抑瘤率。比较了静脉注射后甲氨蝶呤注射剂与含药纳米制剂大鼠体内血浆、心脏、实体瘤、脾脏、肝脏和肾脏的药动学研究,结果制成靶向制剂后,甲氨蝶呤明显改变了在动物体内的分布过程,实体瘤组织中的血药浓度较其它组织偏大,实体瘤组织的相对摄取率re和Ce值最大,重量-总靶向系数TeQ值比较表明,普通制剂中甲氨蝶呤在肿瘤组织分布仅0.2312,而纳米粒制剂中为0.4438,具有明显的肿瘤细胞靶向性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 抗肿瘤靶向给药系统
• 2 甲氨蝶吟的简介
• 3 立题目的及依据
• 第一章 生物素化壳聚糖（B-CS）的合成及表征
• 1 仪器与试药
• 2 B-CS载体的合成方法
• 3 合成条件的影响因素考察
• 3.1 原料配比的影响
• 3.2 催化剂用量的影响
• 3.3 反应时间的影响
• 3.4 反应温度的影响
• 3.5 反应溶媒的影响
• 4 合成条件的优化
• 4.1 采用正交设计优化合成条件
• 4.2 最佳合成条件的验证
• 5 结构的确证
• 5.1 紫外吸收分光光谱（UV）
• 5.2 傅立叶红外分光光谱（FT-IR）
• 1H-NMR）'>5.3 核磁共振氢谱分析（¹H-NMR）
• 5.4 差示扫描量热分析（DSC）溶解性
• 6 B-CS的理化性质
• 6.1 外观性状
• 6.2 溶解性
• 7 讨论
• 8 本章小结
• 第二章 甲氨蝶呤（MTX）纳米粒体外分析方法的建立
• 1 仪器与试药
• 2 MTX的有关物质及含量测定
• 2.1 色谱条件
• 2.2 检测波长的选择
• 2.3 系统适用性试验
• 2.4 专属性试验
• 2.5 线性关系考察
• 2.6 精密度试验
• 2.7 回收率试验
• 2.8溶液中的稳定性试验
• 2.9 检测限与定量限
• 2.10 含量测定
• 2.11 有关物质检查
• 3 MTX纳米粒的有关物质及含量测定
• 3.1 色谱条件
• 3.2 系统适用性试验
• 3.3 专属性试验
• 3.4 线性关系考察
• 3.5 精密度试验
• 3.6 回收率试验
• 3.7 溶液中的稳定性
• 3.8 检测限与定量限
• 3.9 含量测定
• 3.10 有关物质检查
• 4 MTX纳米系统体外释药的测定方法
• 4.1 色谱条件
• 4.2 检测波长的选择
• 4.3 线性关系考察
• 4.4 精密度试验
• 4.5 稳定性试验
• 4.6 回收率试验
• 4.7 载药量和包封率的测定方法
• 5 讨论
• 6 本章小结
• 第三章 甲氨蝶呤生物素化壳聚糖纳米粒（MTX-B-CS-NP）的制备及药剂学研究
• 1 仪器与试药
• 2 空白B-CS-NP的制备
• 2.1 空白B-CS-NP的制备方法
• 2.2 空白B-CS-NP粒径和Zeta电位的测定
• 3 MTX-B-CS-NP的制备
• 3.1 MTX-B-CS-NP的制备方法
• 3.2 MTX-B-CS-NP的制备的影响因素考察
• 4 最佳工艺条件的确定
• 5 MTX-B-CS-NP的表征
• 5.1 MTX-B-CS-NP的粒径和Zeta电位的测定
• 5.2 载药量的测定
• 5.3 MTX-B-CS-NP的体外药物释放
• 6 MTX-B-CS-NP稳定性研究
• 6.1 影响因素试验
• 6.2 加速试验
• 6.3 加速试验
• 7 讨论
• 8 本章小结
• 第四章 MTX-B-CS-NP安全性试验与药效学研究
• 1 安全性试验
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 实验方法与结果
• 2 体外抗肿瘤活性试验
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果及结论
• 22生长的影响'>3 甲胺喋呤纳米粒对小鼠移植性肝癌H₂₂生长的影响
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验结果和结论
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第五章 MTX-B-CS-NP在小鼠体内的药物动力学及组织分布
• 1 实验设计
• 1.1 实验动物
• 1.2 药液配制
• 1.3 给药方案
• 1.4 样品采集
• 1.5 数据处理
• 2 定量分析方法的建立
• 2.1 仪器
• 2.2 药品与试剂
• 2.3 色谱条件
• 2.4 样品处理
• 2.5 分析方法确证
• 2.6 标准曲线制备和定量下限
• 2.7 方法的精密度与准确度
• 2.8 浆样品提取回收率
• 2.9 稳定性考察
• 2.10 未知样品测定
• 3 实验结果
• 3.1 药物动力学研究
• e）'>3.2 相对摄取率（r_e）
• e）'>3.3 相对靶向系数（t_e）
• e^C）'>3.4 总靶向系数（T_e^C）
• e^Q）'>3.5 重量-总靶向系数（T_e^Q）
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢