乳链菌肽抗性蛋白突变体的表达对乳链菌肽产量的影响

论文摘要

乳链菌肽（nisin）是由某些乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）产生的含有34个氨基酸的阳离子抗菌多肽,属于第一类羊毛硫细菌素,可有效抑制包括多种食物腐败菌和病原菌在内的革兰氏阳性菌,并可被人体产生的α-胰凝乳蛋白酶有效降解,对人体安全无毒,是目前唯一大规模商业化应用的高效天然食品防腐剂。在nisin产生菌中,nisin的抗性（免疫）是由nisI编码的脂蛋白（NisI）和nisFEG编码的ABC转运蛋白复合体（NisFEG）共同决定的;然而,在一些不产nisin的L. lactis中,nisin抗性则是由nisin抗性基因（nisin resistance gene, nsr）编码的一个分子量约为35 kDa的nisin抗性蛋白（NSR）决定的。本研究通过基因工程的手段,采用定点突变的方法将nisin抗性基因nsr进行突变,并对突变后的抗性基因编码的蛋白生理功能进行了研究,根据其特有的生理功能又将该突变体蛋白在nisin产生菌中进行克隆与表达。研究取得了如下结果:1) nisin抗性基因nsr的定点突变:对基因nsr编码蛋白NSR的保守结构域进行分析,发现其第236位丝氨酸在所有末端特异性蛋白酶中均保守,可能为其活性中心。因此将NSR第236位丝氨酸突变为丙氨酸（记为NSRS236A）。2)抗性蛋白突变体NSRS236A的生理功能研究:本文构建了表达NSRS236A的L.lactis MG1363重组菌株,用以研究该蛋白的生理功能。Western blot杂交结果显示,和NSR一样,NSRS236A特异性定位于细胞膜上;肽释放实验表明突变体NSRS236A不再具备有降解nisin的功能;表面等离子共振检测表明NSRS236A能与nisin结合。3) NSRS236A的表达对nisin产量的影响:利用nisin抗性蛋白突变体NSRS236A可以结合nisin分子而不会对其行使降解功能的特点,将带有强组成型启动子P59的抗性基因nsrS36A克隆到nisin表达质粒pHJ201上,将重组质粒引入L. lactis NZ9800中,使nsrS36A基因得以表达,比较重组菌株L.lactis NZ9800/pHM582与对照菌株L. lactis NZ9800/pHJ201的生长曲线、对nisin的抗性水平、抑菌活性及nisin产量的差异。结果表明NSRS236A的表达对重组菌的生长速度没有明显的影响,但却能促使重组菌株对nisin的抗性水平提高40%,对指示菌M. flavus NCIB 8166抑菌活性在6h和8h时明显增强,nisin的表达量分别提高1.9倍和27%。本项研究结果突出地表现在:定位于细胞膜上的NSRS236A通过结合细胞表面nisin分子,在细胞表面阻止nisin对自身菌体的破坏,增强了菌体对nisin的抗性水平,提高了nisin的表达量。以上结果说明nisin抗性蛋白突变体NSRS236A的表达可以提高产生菌对nisin的抗性,从而提高nisin产量,为通过基因工程手段提高nisin产量提供了新的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 乳酸菌及其产生的细菌素概述
• 1.1.1 乳酸菌简介
• 1.1.2 细菌素定义及分类
• 1.1.3 细菌素的应用
• 1.2 乳链菌肽的结构特征及生物合成
• 1.2.1 乳链菌肽的结构特征
• 1.2.2 Nisin 的生物合成及其调控
• 1.3 乳链菌肽的作用方式
• 1.4 乳链菌肽的免疫及其抗性机制
• 1.4.1 免疫机制
• 1.4.2 生理适应机制
• 1.4.3 乳链菌肽抗性基因nsr 表达产生的抗性机制
• 2 引言
• 3 实验材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株、质粒及引物
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 生化试剂、工具酶和试剂盒
• 3.1.4 溶液及缓冲液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组表达质粒的构建
• 3.2.2 NSR5236A 在乳酸菌中的细胞亚定位
• 3.2.3 NSR5236A 体内降解Nisin 活性的测定
• 3.2.4 NSR5236A 蛋白的表达与纯化
• 3.2.5 NSRSD5236A 与nisin 的相互作用
• 3.2.6 重组菌及对照菌株生长曲线的测定
• 3.2.7 重组菌与对照菌对nisin 的抗性水平测定
• 3.2.8 重组菌与对照菌发酵上清液抑菌活性的定量测定
• 3.2.9 NSR 和NSR5236A 在nisin 产生菌中的表达检测
• 4 实验结果与分析
• 4.1 表达质粒的构建
• 4.1.1 基因nsr 的定点突变
• 4.1.2 表达质粒pHM482 的构建
• 4.1.3 NSRSD5236A 与GST 融合表达质粒pSZ321 的构建
• 4.1.4 表达质粒pHM582 的构建
• 4.1.5 表达质粒pHM581 的构建及鉴定
• 4.1.6 重组表达菌株的鉴定
• 4.2 NSR5236A 蛋白的功能分析
• 4.2.1 NSR5236A 在乳酸菌中的细胞亚定位
• 4.2.2 NSR5236A 体内降解nisin 活性
• 4.2.3 NSRSDS236A 蛋白的表达纯化
• 4.2.4 NSRSDS236A 对底物 nisin 的结合能力
• 4.3 NSRS236A 的表达对 nisin 产量的影响
• 4.3.1 重组菌与对照菌生长曲线的比较
• 4.3.2 重组菌与对照菌对 nisin 抗性水平的比较
• 4.3.3 重组菌与对照菌发酵液上清抑菌活性及产量的比较
• 4.3.4 NSRN 和 SRS236A 在 nisin 产生菌中的表达检测
• 全文讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 在校期间发表的论文及科研成果