核黄素光化学作用灭活血液及血制品中的淋巴细胞及病原微生物的研究

论文摘要

背景输血是现代医学不可或缺的重要支撑条件,且随着临床医疗技术的发展和社会老龄化程度的提高,其重要性必然随之进一步突显;但另一方面输血亦和多数临床治疗方法一样,存在着一定的不良反应,受血者遭遇输血不良反应的可能性称为输血风险。虽随着输血相关管理和技术措施的改进,输血风险的发生几率已大幅度降低,但由于输血治疗覆盖面广、使用量大,其个案累计绝对数仍相当大,因此,如何在确保临床输血疗效的同时防范输血风险一直是世界卫生组织、各国卫生行政部门和医学界共同关注的热点问题。输血风险主要由感染性输血风险和免疫性输血不良反应两大类构成。艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等多种病毒及某些细菌、原虫等诸多病原微生物可通过输血途径传播而构成感染性输血风险;输血相关移植物抗宿主病（TA-GVHD）则是后果最为严重的免疫性输血风险,一旦罹病,其死亡率高达90%以上。血液成分病原体灭活是杜绝感染性输血风险的关键技术,核黄素光化学法（Riboflavin photochemical treatment,RPT）是近年来在血液成分病原微生物灭活研究领域中被密切关注方法,其有效性和安全性已得到证实。现知核黄素能与核酸结合,在光能作用下所发生的后续反应可导致核酸断裂并阻止核酸复制,由于这一原理在逻辑上亦适用于血液制品中淋巴细胞的灭活,因而引起了有关研究者的兴趣。用RPT方法灭活T淋巴细胞以预防TA-GVHD研究的预期目标是建立一种事半功倍、能同时灭活病原微生物和淋巴细胞的方法,以简化血液安全处理的程序,避免反复处理对血液成分造成的不良影响。核黄素作为一种人体所必需的维生素,具有对人体无害的特点。目的本研究中拟用400nm～500nm波段的可见光替代目前多数研究中使用的紫外光源,减少光源本身对血液成分的不良影响,研究该波段光源所激发的核黄素光化学反应对淋巴细胞,细菌,病毒的灭活作用,并对其灭活病原体的机理进行探讨分析。方法将含有淋巴细胞或者细菌、病毒的培养液输注入血袋中,再加入核黄素溶液,核黄素终浓度为100umol/L,混匀后将血袋放在控温光照仪中,从血袋上下两侧照射,照射剂量为8.0J/ml～32.0J/ml,照射时温度为4℃。照射后标本通过淋巴细胞存活趋势,增殖抑制率,细胞周期,细胞因子分泌量,细胞形态变化,细胞凋亡及核酸损伤等检测,分析核黄素光化学作用灭活淋巴细胞的效果和机理;通过大肠杆菌培养,电镜观察,核酸检测分析核黄素光化学作用灭活大肠杆菌的效果和机理;通过病毒滴度检测(细胞脖浞?,电镜观察和核酸检测分析核黄素光化学作用对sindbis病毒的灭活效果和机理。结果可见光激发下的核黄素光化学作用可抑制淋巴细胞增殖,使淋巴细胞在形态和功能上都失去增殖特征,导致淋巴细胞死亡。实验组淋巴细胞对PHA和CD3单抗刺激后的增殖抑制率分别达（99.01±1.30）%和（99.14±1.00）%;RPT可阻止淋巴细胞进入细胞增殖周期和细胞因子分泌,经PHA刺激后,实验组淋巴细胞细胞因子IL-1β,IL-2,IL-6,IL-8,TNF-α和IFN-γ分泌量受到抑制分别达95.09%±2.60%,98.20%±1.64%,98.77%±0.97%,92.30%±11.04%,98.82%±1.42%和100%,经CD3单抗和CD28单抗刺激后,实验组淋巴细胞细胞因子IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α,IFN-γ分泌量受到抑制达89.13%±14.73%,99.02%±0.72%,94.35%±4.93%,84.41%±19.55%和100%;核黄素光化学作用灭活后的淋巴细胞线粒体和内质网肿胀破裂,细胞核聚缩,无DNA ladder出现,未检测到磷脂酰丝氨酸发生外翻,无caspase-3蛋白表达,bax基因转录量未增加,bcl-2基因转录未降低,细胞DNA严重损伤,导致一部分淋巴细胞在灭活过程中死亡,另一部分淋巴细胞灭活后进入无序坏死直至死亡。相同波段内,核黄素光化学作用可以有效灭活大肠杆菌和sindbis病毒分别达6log和5log,使大肠杆菌和sindbis病毒的核酸受到损伤,影响核酸的复制,导致大肠杆菌和sindbis病毒的死亡。结论1.可见光激发的核黄素光化学作用可以有效灭活淋巴细胞,抑制其增殖和产生细胞因子的能力（国际首次报道）。2.可见光激发的核黄素光化学作用可以有效灭活大肠杆菌,sindbis病毒两种具有指示意义的病原微生物（国内首次报道）。3.核酸是核黄素光化学产生病原体灭活作用的主要靶点。上述研究结果提示可见光激发的核黄素光化学作用有可能发展为一种可以同时预防TA-GVHD和输血相关病原微生物感染的有效并且可行的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 综述
• 第一章 血液及血液制品中病原体灭活方法及进展
• 参考文献
• 第二章 核黄素光化学法综述
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第一章 核黄素光化学作用灭活血液及血制品中淋巴细胞效果研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 核黄素光化学作用灭活淋巴细胞机理探讨
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 核黄素光化学作用灭活大肠杆菌的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四章 核黄素光化学作用灭活 Sindbis病毒的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录
• 致谢
• 附件