工程菌株木糖代谢相关基因表达及发酵葡萄糖/木糖产乙醇条件优化

论文摘要

随着化石能源的消耗,挖掘可再生的清洁能源成为新的发展趋势。乙醇因其清洁、可再生及方便运输等优势被认定为最有发展前景的可再生能源。以木质纤维素类生物质生产乙醇,不仅拓宽了燃料乙醇的原料来源,而且可以解决农林废弃物带来的环境污染问题。木质纤维素类原料水解后产生大量单糖,含量最高的是葡萄糖和木糖。若要实现木质纤维素到乙醇的有效转化,木糖的利用显得尤为重要。自然界中可以利用木糖的微生物大约有100多种。然而作为乙醇发酵优势菌株的酿酒酵母却不能有效利用木糖,且可以利用木糖的酵母菌发酵性能也不是很完美。因此酿酒酵母常作为受体菌株,接受其他酵母的木糖代谢基因,从而适应工业化的要求。本实验室通过原生质体融合以及基因工程等方法,已经成功构建一系列可以利用木糖的重组工程菌株。这些菌株与亲本株相比,其木糖利用率、乙醇产量以及乙醇得率都有所提高。然而,这些工程菌株是否可以用于工业生产,以及其木糖代谢流究竟是否完整仍需进一步验证。上述工程菌株中,通过原生质体融合获得的ZLYRHZ7的乙醇产量最高,可以达到21.37g/L。当摇床转速为200 r/min,采用针孔胶塞进行发酵时,其乙醇产量是25.48±0.23g/L。试验首先验证工程菌株ZLYRHZ7体内各个木糖代谢相关基因在DNA水平、RNA水平以及蛋白质水平的情况,结果表明,通过PCR检测,工程菌株ZLYRHZ7分别扩增出972 bp、1113bp和1831 bp的木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因。通过对工程菌株转录水平和翻译水平的分析发现,工程菌株ZLYRHZ7的木糖还原酶基因xyl1转录水平最大值为266.37,酶活力为7.4997±0.0233 U/mg；木糖醇脱氢酶基因xy12最高转录水平为418.61.,酶活力为18.6172±0.0253 U/mg；木酮糖激酶基因xks的转录水平达到317.38,酶活力为136.9574±0.3583 U/mg。这表明,在工程菌株ZLYRHZ7体内确实存在着和木.糖代谢有关的基因,并且其有转录和表达活性。为验证工程菌株ZLYRHZ7体内木糖代谢流是否通畅,试验以不同的中间代谢产物作为唯一碳源进行发酵,发现均可以产生乙醇,其乙醇产量和乙醇得率分别为：2.419±0.027 g/L和0.420±0.003 g/g(木糖,10 g/L).1.672±0.0027 g/L和0.287±0.003 g/g(木糖醇,10 g/L).0.444±0.003 g/L和0.149±0.005 g/g(木酮糖,10 g/L)。这说明工程菌株ZLYRHZ7体内木糖代谢流通畅,也间接证明该工程菌株确实由原生质体融合后产生的。本课题研究为构建高效利用木糖的重组菌体提供依据,为以木质纤维素类生物质能源为原料进行生物乙醇的生产提供了参考依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 木质纤维素类生物质资源生产燃料乙醇
• 1.1.1 木质纤维素燃料乙醇的生产及其意义
• 1.1.2 国内外燃料乙醇的研究进展
• 1.2 木糖利用微生物及木糖代谢途径
• 1.2.1 可以利用木糖的微生物
• 1.2.2 木糖代谢途径及工程菌株的改造
• 1.3 影响木糖发酵的因素
• 1.3.1 溶氧
• 1.3.2 pH值
• 1.4 重组菌株的代谢流研究
• 1.5 课题研究的目的和意义
• 1.5.1 课题研究的目的
• 1.5.2 课题研究的意义
• 1.6 课题研究路线
• 1.7 课题资助名称
• 第2章 实验材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 PCR扩增引物
• 2.1.4 主要生物化学及分子生物学试剂
• 2.1.5 主要生化试剂及缓冲液配制方法
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 出发菌株的选择
• 2.2.2 出发菌株发酵条件的优化
• 2.2.3 出发菌株产醇能力验证
• 2.2.4 基因表达水平验证
• 2.2.5 QT-PCR研究木糖各代谢基因转录表达情况
• 2.2.6 木糖代谢各基因酶活表达情况
• 2.2.7 验证木糖代谢流是否通畅
• 2.3 乙醇检测方法和统计分析
• 2.3.1 HPLC·检测乙醇方法
• 2.3.2 统计分析方法
• 第3章 结果与分析
• 3.1 出发菌株的选择
• 3.1.1 不同工程菌株混和碳源发酵
• 3.1.2 试验菌株利用葡萄糖/木糖发酵产醇情况
• 3.2 工程菌株ZLYRHZ7的生长特点
• 3.2.1 工程菌株ZLYRHZ7的生长曲线
• 600nm和菌体干重之间关系'>3.2.2 工程菌株ZLYRHZ7的OD_600nm和菌体干重之间关系
• 3.3 工程菌株ZLYRHZ7发酵条件的优化
• 3.3.1 不同溶氧条件对工程菌株ZLYRHZ7发酵的影响
• 3.3.2 不同碳源比例对工程菌株ZLYRHZ7发酵的影响
• 3.3.3 ZLYRHZ7在优化的摇瓶条件下利用不同浓度葡萄糖和木糖产醇能力验证
• 3.4 工程菌株ZLYRHZ7基因表达结果
• 3.4.1 工程菌株基因组的提取结果
• 3.4.2 木糖代谢相关基因PCR扩增结果
• 3.5 工程菌株ZLYRHZ7转录水平分析结果
• 3.5.1 工程菌株ZLYRHZ7 RNA提取结果
• 3.5.2 QRT-PCR检测结果
• 3.6 基因表达水平-蛋白酶活的测定
• 3.6.1 考马斯亮蓝测定总蛋白质浓度结果
• 3.6.2 木糖还原酶酶活力的测定结果
• 3.6.3 木糖醇脱氢酶酶活力的测定结果
• 3.6.4 木酮糖激酶酶活力的测定结果
• 3.7 工程菌株ZLYRHZ7代谢流的验证
• 3.7.1 工程菌株ZLZYRHZ7木糖一木糖醇代谢通路的验证
• 3.7.2 工程菌株ZLYRHZ7木糖醇-木酮糖代谢通路的验证
• 3.7.3 工程菌株ZLYRHZ7木酮糖下游代谢通路的验证
• 第4章 结果讨论
• 4.1 溶氧对于发酵的影响
• 4.2 底物对于发酵结果的影响
• 4.3 木糖代谢相关基因表达情况
• 4.4 工程菌株ZLYRHZ7木糖代谢通路的验证
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢