唐学磊1魏丽惠2(1.首都医科大学附属北京友谊医院妇产科；2.北京大学人民医院妇产科100044)
【摘要】目的:研究前列腺素PGE2受体EP2在子宫内膜癌中的表达，探讨EP2在子宫内膜癌中的表达变化及其在子宫内膜癌的发生、发展过程是否存在非雌激素依赖的作用。方法:选取50例子宫内膜癌组织，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，半定量研究各组中EP2的mRNA表达；采用免疫组织化学技术，测定组织中雌、孕激素受体的表达。结果:子宫内膜癌G1组、G2组、G3组均高于正常组（P<0.05)，而且随细胞分化越差，受体表达水平呈上升趋势(P<0.001)；子宫内膜癌I期组、II期-IV期组均高于正常组（P=0.001）；在子宫内膜癌中，雌激素受体表达阴性组比阳性组的EP2表达水平显著升高（P<0.001）；而孕激素受体表达阴性组比阳性组的EP2表达水平高，但是差异无统计学意义（P>0.05）；绝经前（20例）与绝经后（30例）患者的子宫内膜癌中EP2的表达分别为0.905±0.251和0.941±0.336，二者差异无统计学意义（P=0.684）。结论:在子宫内膜癌中EP2表达水平高于正常子宫内膜，并且随分期和分级升高有上升趋势，在雌激素表达阴性的子宫内膜癌比阳性者明显升高，提示PGE2及其受体EP2可能参与了子宫内膜癌的形成。在子宫内膜癌的形成过程中，，前列腺素及其受体EP2与非雌激素作用的子宫内膜癌形成过程存在某种联系，可能是PGE2通过EP2受体介导的信号通路的传导起作用。
【关键词】子宫内膜癌；EP2受体；雌激素受体ER；孕激素受体PR
【中图分类号】R737.33【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2010）11-0006-02
子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，近年来在全球发病呈逐年上升趋势。在近年临床实践研究中可以观察到子宫内膜癌分为雌激素依赖性和非雌激素依赖性。雌激素依赖性肿瘤的雌孕激素受体（ER与PR）为阳性表达，一般分期早、分化好，治疗及预后较好；而非雌激素依赖性肿瘤则常常ER与PR为阴性表达，临床表现为分期晚、分化差、进展快、对内分泌治疗疗效不好，预后差。
研究显示，前列腺素受体（EP2）表达升高及前列腺素E2（PGE2）合成增加可诱导上皮细胞发生恶变，在子宫内膜癌中，EP2和PGE2起何种生物学作用尚未阐明。EP2的作用、其胞内信号途径，及其与介导PGE2对正常细胞和肿瘤上皮细胞起转化作用的靶基因的关系仍不清楚。
本研究通过研究受体EP2在子宫内膜癌中的表达，探讨EP2在子宫内膜癌中的表达变化与激素依赖的关系；在子宫内膜癌的发生、发展过程中是否存在非雌激素受体的作用。
1材料与方法
1.1研究对象:选取1999年7月-2002年7月间，年龄36-77岁的子宫内膜癌患者50例，根据FIGO手术病理分期：I期29例、II期7例、III期12例、IV期2例，G1级26例、G2级15例、G3级9例)，正常子宫内膜10例，术前未经放化疗及激素等内分泌治疗，术中取同一子宫内膜癌病变组织两份，一份用10%甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色，并经病理医师确诊；另一份标本离体后立即放入液氮速冻4hr以上，然后保存于-70℃低温冰箱备用。
1.2实验方法
1.2.1RNA提取：取每例冻存组织标本约100mg，在4℃匀浆，参照Trizol试剂盒（Promega公司）说明书提取RNA。RNA产物在紫外分光光度计260/280处测定RNA样品的吸光度值，计算样品的纯度及浓度。取5ulRNA样品于1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪下观察结果并记录。
1.2.2引物设计[1]：内参照引物GAPDH：上游5’-CGGATTTGGTCGTATTGG-3’，下游5’GATGGCATGGACTGTGGT-3’,扩增片段长517bp;受体EP2:上游5’-CTTACCTGCAGCTGTACG-3’，下游5’-GATGGCAAAGACCCAAGG-3’，扩增片段长367bp。以上引物均由上海博雅生物技术公司合成。
1.2.3所有子宫内膜组织EP2的mRNA表达水平测定：采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，逆转录试剂均为美国Promega公司产品。逆转录反应体系25ul：5*RT缓冲液5ul，Dntp(10mM)5ul,Rnasin(50u/ul)0.5ul,随机引物（0.5ug/ul）2ul，M-MLV逆转录酶（200u/ul）1ul，样品RNA2ug，加入三蒸水至终体积25ul。反应条件：37℃水浴1hr，95℃水浴5min灭活逆转录酶。PCR反应体系25ul：10*PCR缓冲液2.5ul，MgCl2(25mmol/L)1.5ul,dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L)2.0ul，目的片段上、下游引物（各25pmol/ul）各1ul，GAPDH上、下游引物（各pmol/ul）各0.5ul，样品cDNA2.0ul，Taq酶（5u/ul）0.3ul，加入三蒸水至终体积25ul。EP2和GAPDH扩增条件：94℃预变性1min；循环条件，95℃变性45s,60℃退火1min,72℃延伸1min,72℃后延伸5min,35个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳后观察，密度扫描分析仪测定光密度值，以EP2与GAPDH的比值来评定EP2mRNA的表达水平。
1.2.4子宫内膜组织ER和PR的免疫组织化学检测：
(1)试剂：识别ER、PR的鼠抗人单抗ZM-0104和ZM-0215（购自美国Zymed公司）
(2)方法：二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.3%H2O2去内源性过氧化物酶，抗原修复，加入一抗4℃过夜，加入二抗37℃30min，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。
(3)结果判定：阳性染色为棕黄色或橘黄色颗粒，多位于细胞核内。
(4)阳性对照为乳腺癌组织；阴性对照是用PBS替代一抗的替代对照。
1.3统计学方法:数据以X±SD表示，采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析和SNK-q检验统计学分析。
2结果
2.1子宫内膜癌组织中提取RNA的完整性及纯度:RNA电泳均可见28S、18S、5S三条带，提取的RNA基本完整。RNA的OD260/OD280为1.7-2.0，其纯度已达到实验要求。提取的每例组织总RNA含量为0.6-1.25ug/ul。
2.2子宫内膜癌组织分化程度与EP2mRNA表达的关系:子宫内膜癌G1组、G2组、G3组均高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05，P=0.0005)，而且随细胞分化越差，受体表达水平呈上升趋势，差异有统计学意义(P<0.001)（见表1）。
表1子宫内膜癌细胞分化程度与EP2的的关系
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*RT-PCR扩增EP2条带密度比值（X±SD）
2.3子宫内膜癌分期与EP2mRNA表达的关系:子宫内膜癌I期组、II期-IV期组均高于正常组，差异有显著统计学意义（P=0.001），并随分期变化，分期越晚，表达值升高，期别之间相比差异无统计学意义（P=0.17）（见表2）。
表2子宫内膜癌细胞不同期别与EP2的关系
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*RT-PCR扩增EP2条带密度比值（X±SD）
2.4绝经前后患者的子宫内膜癌与EP2的关系:绝经前（20例）与绝经后（30例）患者的子宫内膜癌中EP2的表达分别为0.905±0.251和0.941±0.336，二者差异无统计学意义（P=0.684）。
2.5在子宫内膜癌中雌激素受体与EP2的关系:在子宫内膜癌中，雌激素受体表达阴性组比阳性组的EP2表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.001）（见表4）。
表3子宫内膜癌中雌激素受体（ER）与EP2的关系
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*P<0.001**RT-PCR扩增EP2条带密度比值（X±SD）
2.6在子宫内膜癌中孕激素受体与EP2的关系：在子宫内膜癌中，孕激素受体表达阴性组比阳性组的EP2表达水平高，但是差异无统计学意义（P>0.05）（见表5）。
表4子宫内膜癌中孕激素受体（PR）与EP2的关系
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*RT-PCR扩增EP2条带密度比值（X±SD）
3讨论
子宫内膜癌的内分泌治疗开始于20世纪60年代，孕激素治疗子宫内膜癌的机理尚不十分清楚，可能是直接作用于癌细胞，延缓DNA的复制和转录，或通过酶和生长因子等间接地抑制癌细胞的生长。临床观察孕激素对病理分化程度高和ER\PR阳性的子宫内膜癌患者的有效率可达25%左右[1]。但一些分化差，ER\PR阴性的子宫内膜癌患者的激素治疗效果不理想，复发率高。因而对其机制及解决办法的研究一直备受关注。
前列腺素PGE2作为花生四烯酸AA代谢产物，在妊娠到分娩的发动中，在炎性组织的免疫反应中，以及肿瘤的形成中，都起着重要的作用。
3.1前列腺素PGE2及其受体：前列腺素PGE2受体有四种亚型，即EP1、EP2、EP3、EP4，在不同的靶细胞中表达，分别介导不同的PGE2依赖性生物学效应。1999年Smock等人发现EP2受体的编码基因位于第4号染色体，EP2受体有358个氨基酸组成[2]。
PGE2作为花生四烯酸的环氧化物，COX-2是其反应的限速酶，而EPs是PGE2的膜受体。PGE2通过与跨膜G蛋白偶联的受体EPs相互作用，这些前列腺素受体与G蛋白偶联后，激活或阻断胞内第二信使系统，从而介导其对靶细胞的作用[3]。
3.2前列腺素PGE2及其受体与妇科肿瘤的关系：近年研究显示，在妊娠分娩发动及炎症反应中起重要作用的PGE2与肿瘤形成过程中的生物学行为也密切相关。正常细胞与癌细胞之间EP2受体表达的差异可能是PGE2介导癌变的原因。研究表明组织中PGE2对癌变的作用基本上是依赖于PGE2受体的表达。
Konger等认为应用分子干扰或药物降调的手段使EP2受体表达缺失，都会导致肿瘤转移的显著增加[4]。Konger等还证实EP2受体活化可刺激皮肤癌生长，EP2受体可以看作是皮肤癌形成早期的肿瘤启动子[4]。而在另外的一些实验中，通过COX-2、EP2、EP4基因敲出小鼠的肠腺瘤生长受抑制证明EP2受体的肿瘤启动子作用也在其它组织中出现，降调EP2使肿瘤生长受抑制。
Miline等应用原位杂交探针技术检测到在子宫内膜上皮层中EP2受体和EP4受体有表达[5]。而Jabbour则检测到在子宫内膜癌上皮细胞中EP4受体呈高表达[6]。EP受体在癌组织中的作用是通过外源性的PGE2刺激作用，在子宫颈癌中已有报道，说明在生殖道肿瘤中这一信号通路的存在可能具有促癌形成及转移的作用[7]。
本研究显示，在子宫内膜癌中，EP2受体的表达较正常子宫内膜明显升高。说明在子宫内膜癌形成过程中，炎症可能是雌激素过渡刺激以外的又一致癌因素
此外，随年龄的增长，绝经前、后两组的子宫内膜癌中EP2受体的表达变化没有显著差别。
在对妊娠分娩发动的研究中,发现孕激素可上调去卵巢大鼠子宫平滑肌的EP2受体表达,而且,孕激素拮抗剂可使妊娠子宫平滑肌EP2受体的表达下调，提示甾体类激素可能在其中起作用[8]。本研究结果显示，在子宫内膜癌中，雌激素受体表达阴性者的EP2受体表达水平高于雌激素受体表达阳性者，差别有显著统计学意义；而EP2受体与孕激素受体的关系不明显,提示前列腺素及其受体EP2可能与非雌激素作用的子宫内膜癌形成有关。
本研究结果显示，随子宫内膜癌细胞分化越差EP2受体mRNA表达水平越高。提示受体在子宫内膜癌的形成及进展过程中，可能不只起到肿瘤启动子的作用。
本研究显示EP2受体的表达随期别进展而升高的趋势并不明显，说明在子宫内膜癌进展的过程中EP2受体的作用并非是高度特异的。但是，这些结果提示EP2受体的特异性拮抗剂或许可以与激素的内分泌治疗协同作用，为子宫内膜癌的药物治疗提供新的思路。
参考文献
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[2]SmockSL,PanLC,CastleberryTA,etal.Cloning,structuralcharacterizationandchromosomallocalizationofthegeneencodingthehumanprostaglandinE2receptorEP2subtype.Gene.1999,17:237
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[4]KongerRL,ScottGA,LandtY,etal.LossoftheEP2prostaglandinE2receptorinimmortalizedhumankeratinocytesresultsinincreasedinvasivenessanddecreasedpaxillinexpression.AmJPathology.2002,161(6):2065-2078
[5]MilneSA,PerchickGB,BoddySC,etal.Expression,localizationandsignalingofPGE2andEP2/EP4receptorsinhumannon-pregnantendometriumacrossthemenstrualcycle.JClinEndocrinolMetab.2001,86(9):4453-9
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[8]DongYL,YallampalliC.PregnancyandexogenoussteroidtreatmentsmodulatetheexpressionofrelaxantEP2andcontractileFPreceptorsintheRatuterus.BiologyofReproduction.2000,62:533-539