蔷薇科部分果树S基因的鉴定、克隆及其特异性识别研究

论文摘要

梨和梅等蔷薇科果树的多数品种自花授粉不结果,生产上必须配置合理的授粉树才能获得应有的产量和品质,授粉品种的配置应根据品种的S基因型来确定,但目前梨和梅多数品种的S基因型尚待鉴定；同时,对于S单元型结构相似性很高的不同果树种或属间是否存在相同的识别特性等问题尚未见报道。本研究以梨、梅等果树为试材,开展S基因型鉴定及种或属间识别特异性研究,主要结果如下：一、应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,并对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,在秋子梨‘麦梨’、‘内蒙古山梨’中分别鉴定出2个新S-RNases基因,命名为S40-、S41-RNase（DQ903313、DQ988687）。同时鉴定出20个梨品种或野生类型个体的S基因型。‘奥连’（SpS32）、‘吊蛋’（SdSe）、‘沙疙瘩’（S36Sd）和杏叶梨的一个类型（S22Sc）等一些起源于我国的梨品种或野生类型个体中存在西洋梨的S-RNase基因,进一步证实S-RNase基因分化发生在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。S40-RNase基因推导的部分氨基酸序列与苹果属S11-RNase的同源性为100%,两者的内含子有13 bp差异,其同源性为94.3%。二者基因组结构很高的相似性表明,S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。二、应用PCR扩增技术首次对11个我国培育和1个引进的梅品种S基因型进行鉴定。通过序列分析,分离了7个新S-RNase基因,分别命名为S10-～S16-RNase,在GenBank的登录号分别为DQ011150、DQ201191、DQ201192、DQ345781、DQ768219、DQ903312和EF990750；分析了梅新S-RNases基因与已知S-RNases基因的差异。12个梅品种S基因型分别为：‘小叶猪肝’为S10S14‘红顶’为S15S16,‘龙眼梅’为S13S14,‘复瓣跳枝’为S1S13‘多萼朱砂’为S3S4,‘淡桃粉’为S4S12,‘青丰’、‘青佳’、‘细叶青’、‘大叶青’和‘长农17’均为S3S15,’Musashino’为S5S11。本研究率先报道了我国育成梅品种的S基因型,为梅田间合理配置授粉品种及其深入研究自交不亲和与亲和性机理提供参考。三、利用3’-RACE和5’-RACE克隆出梅中7个新雌蕊S-RNase基因的cDNA全序列。梅S-RNase基因氨基酸序列与蔷薇科中其它种内S-RNase基因之间相比较表现出种内同源性高于种间同源性。7个新S-RNases与蔷薇科S-RNases结构完全一致：5个保守区域C1、C2、C3、C5和蔷薇科特有的保守区域RC4。通过聚类分析,研究了7个梅S-RNases与李属其它种内S-RNases和梨属、苹果属S-RNases,表明梅S-RNases并未形成特异的种群分支,而是分布于李属S-RNases内,并且与其它S-RNase表现出较高的不同种间序列同源性。李属S-RNase与梨属、苹果属S-RNase形成两个独立的进化分支。四、根据李属中已经鉴定出的SFB基因保守区域设计引物,对12个梅品种进行PCR扩增,进一步研究梅花粉SFB基因结构特征。通过PCR产物的序列分析,依据两个品种包含同一基因的方法确定各个S-RNase基因相对应的SFB,0～SFB16等7个SFBs基因,它们之间的同源性为86.4%（SFB13与SFB,4）～99.2%（SFB11与SFB15）。SFB基因包括位于N端的一个非常保守的F-box结构域、两个变化区域V1和V2和两个高变区域HVa和HVb。变化区域V2和两个高变区域HVa和HVb均位于SFB基因的C端,表明这些变化区域很可能对S-RNase基因的特异性识别起重要作用。分别根据各个S-RNase基因特异引物与SFB基因3’端设计的保守引物对梅品种基因组DNA进行扩增得到了S10～S13单元型中S-RNase基因与SFB基因之间的物理距离。五、序列分析结果表明,梅S13和杏S9单元型中S-RNases、SFBs氨基酸序列均表现出高度的序列同源性,分别为99.1%和99.2%。梨属砂梨‘明月’中S8-RNase与新疆梨‘库尔勒香梨’中S28-RNase氨基酸序列完全一致,同源性为100%；苹果属‘海棠3号’中S3-RNase基因与梨属‘明月’中S8-RNase,二者仅有7个氨基酸残基的差异,并且高变区完全相同,同源性为96.9%。具有长度和序列多态性的内含子也高度保守,同源性分别为95.3%和91.9%。利用花粉管荧光观察、S糖蛋白离体培养花粉和杂交F1代中S基因的分离规律等方法验证PmS13/ParS9、PpS8-RNase/PsiS28-RNase和PpS8-RNaselMsS3-RNase的特异性识别功能。结果表明,李属PmS13和ParS9不同种间S单元型均受SI控制,并且通过添加S糖蛋白离体培养花粉的方法证实了两个单元型很可能具有相同的特异性识别功能；梨属PpS8-RNase和PsiS28-RNase在分化为两个种以后仍然保持相同的特异识别性；在梨属PpS8-RNase和苹果属MsS3-RNase中,尽管二者氨基酸存在着一定的变异,但可能并未改变其特异识别功能。这些具有较高序列同源性不同种间S单元型可能来自：（1）同一种属内分化形成不同种时,同一个原始S单元型遗传于进化形成的两个不同种内；（2）种属内不同种形成以后,不同种属间的基因渗透。

论文目录

• 缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1. 花柱SI决定因子:S-RNase基因
• 1.1 S-RNase基因结构和功能
• 1.2 S-RNase与自交（不）亲和性的关系
• 1.3 S基因型鉴定方法
• 2. 花粉决定因子:SLF/SFB基因
• 2.1 SLF/SFB基因结构特点及连锁距离
• 2.2 SFB基因与自交不亲和性及亲和性的关系
• 2.3 鉴定SFB基因的方法
• 2.4 S-RNase基因与SFB基因的相互作用
• 3. 参与S-RNase介导SI反应的其它因子
• 3.1 HT修饰基因
• 3.2 120KDa蛋白
• 4. S-RNase介导的SI反应学说
• 4.1 膜受体学说
• 4.2 胞内抑制剂学说
• 4.3 修正抑制子模式学说
• 4.4 其它新的学说
• 5. S位点结构
• 6. 新S基因特异性的产生
• 7. SI的打破及种间育种壁垒
• 8. 研究目的与意义
• 第一章 梨和梅种质资源S基因型鉴定
• 40-和S₄₁-RNase基因序列分析'>第一节 梨20个品种（类型）S基因型的鉴定及S₄₀-和S₄₁-RNase基因序列分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 S基因型鉴定
• 2.2 新S-RNases基因核苷酸序列分析
• 3. 讨论
• 第二节 梅品种S基因型及7个新S-RNases基因的鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 田间授粉
• 2. 结果与分析
• 2.1 梅品种S基因型及新S-RNase基因的鉴定
• 2.2 梅新S-RNases基因与已知S-RNases基因之间的比较分析
• 3 讨论
• 3.1 引物对PCR扩增产物的影响
• 3.2 S-RNase基因高变区与自交不亲和性的关系
• 第二章 梅雌蕊S-RNase基因的克隆
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 DNA和RNA的提取
• 1.3 梅S-RNase基因cDNA序列的扩增
• 1.4 梅S-RNase第一内含子的扩增
• 2. 结果与分析
• 2.1 梅S-RNase基因cDNA的克隆
• 2.2 梅S-RNase基因第一、二内含子的扩增
• 2.3 梅S-RNases基因与李属其它种内S-RNases基因氨基酸序列的比较
• 3. 讨论
• 3.1 梅S-RNase基因保守区域的差异
• 3.2 李属S-RNase基因包含了两个内含子
• 第三章 梅花粉SFB基因的克隆与结构分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 10～PmSFB₁₆的扩增与分离'>1.2 梅PmSFB₁₀～PmSFB₁₆的扩增与分离
• 10～PmSFB₁₆基因5'端内含子的扩增'>1.3 梅PmSFB₁₀～PmSFB₁₆基因5'端内含子的扩增
• 1.4 梅S-RNase基因与SFB基因之间物理距离分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 梅SFB基因的扩增
• 2.2 梅S-RNase基因与SFB基因之间的物理距离
• 2.3 李属植物SFB基因内含子的比较
• 2.4 梅SFB基因与李属其它SFB基因的比较
• 3. 讨论
• 3.1 李属S单元型中SFB基因结构特点
• 3.2 李属SFB基因5'端内含子
• 3.3 李属植物S单元型中S-RNase基因和SFB基因的共同进化
• 第四章 不同种属间S单元型特异性识别功能研究
• 第一节 李属不同种间S基因特异性识别功能验证
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 DNA和RNA的提取
• 1.3 反转录cDNA第一链的合成
• 1.4 S-RNase基因的扩增
• 1.5 花柱S糖蛋白的提取
• 1.6 花柱S糖蛋白浓度的测定
• 1.7 荧光观察花柱中花粉管生长
• 1.8 花粉的液体荫发培养
• 2. 结果与分析
• 2.1 花粉管荧光观察
• 2.2. 离体条件条件下S-RNase对花粉萌发及生长的影响
• 3. 讨论
• 3.1 花粉管荧光观察
• 13-RNase与‘冀光’S₉-RNase识别功能的验证'>3.2 ‘龙眼梅’S₁₃-RNase与‘冀光’S₉-RNase识别功能的验证
• 3.3 不同种间S单元型特异性识别
• 3.4 序列同源性较高S单元型的来源
• 第二节 梨属和苹果属不同种间S单元型的识别
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 叶片DNA和RNA的提取
• 1.3 cDNA的合成
• 1.4 S-RNase基因的扩增
• 1.5 花柱S糖蛋白的提取
• 1.6 花柱S糖蛋白浓度的测定
• 1.7 田间授粉
• 1.8 梨品种‘明月’花粉的培养
• 2. 结果与分析
• 8-RNase和新疆梨PsiS₂₈-RNase不同种间特异性识别功能分析'>2.1 砂梨PpS₈-RNase和新疆梨PsiS₂₈-RNase不同种间特异性识别功能分析
• 8-RNase与苹果属‘海棠3号’MsS₃-RNase特异性识别功能分析'>2.2 梨属‘明月’PpS₈-RNase与苹果属‘海棠3号’MsS₃-RNase特异性识别功能分析
• 3. 讨论
• 3.1 活体花柱中S-RNase对不同花粉管生长的影响
• 8-RNase和新疆梨PsiS₂₈-RNase不同种间特异性识别功能'>3.2 砂梨PpS₈-RNase和新疆梨PsiS₂₈-RNase不同种间特异性识别功能
• 8-RNase和苹果属MsS₃-RNase不同属间特异性识别功能'>3.3 梨属PpS₈-RNase和苹果属MsS₃-RNase不同属间特异性识别功能
• 3.4 S位点的进化
• 3.5 新S位点的产生
• 综合讨论
• 1. 蔷薇科果树种质资源S基因型鉴定及S基因的克隆
• 2. 蔷薇科植物S单元型结构特点与功能
• 3. 梨属与李属S单元型中内含子的差异
• 4. 蔷薇科植物S单元型的进化
• 4.1 蔷薇科植物不同种间S-RNase基因的进化
• 4.2 蔷薇科植物不同种间SFB基因的进化
• 5. 不同种属间S单元型的特异性识别功能
• 6. 新S位点的产生
• 全文结论及主要创新之处
• 1. 全文结论
• 2. 创新点
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢