快速检测鱼类淋巴囊肿病毒和海洋双RNA病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

论文摘要

淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus,LCDV）广泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中,可感染9目34科共计140种以上鱼类,是对鱼类危害较为严重的病毒病之一,其感染率可高达80%,死亡率可达30%。本研究根据GenBank登录的淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白（MCP）基因序列（AB212999）,选择其高度保守区域,利用Primer Explorer V3软件进行引物设计,建立了用于检测淋巴囊肿病毒的环介导恒温扩增方法,对LCDV-LAMP反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度并用建立的方法对109尾牙鲆进行了检测。特异性试验证实,该方法只能检测LCDV核酸,与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都无交叉反应,具有高度的特异性。将LAMP与常规PCR及实时定量PCR的检测限进行比较分析,结果表明LAMP与实时定量PCR的检测限一致约为15龟,比常规PCR灵敏度高10倍。用建立的LCDV-LAMP与常规PCR检测109尾牙鲆样品,结果显示,两者对健康和发病严重的样品检测结果一致,但对无临床症状的样品存在8尾差异;经2次实时定量PCR复检差异样品,均与LAMP一致,表明LAMP较常规PCR的检测灵敏度更高,而且从样品的制备到获得结果仅需2 h,具有检测周期短的优势。以上结果表明,采用LAMP法检测淋巴囊肿病毒具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短等特点,比较适合养殖场、出入境口岸进行淋巴囊肿病毒的现场、即时检测。海洋双RNA病毒（Marine birnavirus,MABV）广泛分布于世界各地的海水中,可感染30科11种软体、4种甲壳动物和10多种鱼类,特别是对鲫幼鱼危害严重的病毒病之一,其感染率可高达85%,死亡率可达62%。本研究根据GenBank提供的海洋双RNA病毒聚合蛋白（polyprotein）的VP2基因序列（D61384）,利用PrimerExplorer V3软件进行引物设计,建立了海洋双RNA病毒的反转录环介导恒温扩增方法。对MABV RT-LAMP反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性和灵敏度,并采用优化了的方法对养殖场送检的鲈鱼、真鲷、大菱鲆和牙鲆各30尾进行MABV的检测。结果显示,该方法对MABV核酸有高度的特异性,与染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春血症病毒、病毒性出血败血症病毒及病毒性神经坏死病毒都无交叉反应。灵敏性试验发现,该方法最低检测限为16.6fg总RNA,与实时定量RT-PCR的检测限一致,但比常规PCR灵敏度高10倍。对养殖场送检的120份样品进行RT-LAMP和实时定量PCR海洋双RNA病毒检测,结果显示两种方法的检测结果完全一致,表明RT-LAMP具有更高的灵敏度。以上结果表明,本研究所建立的MABV RT-LAMP能对海洋双RNA病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、检测成本低廉等优点,可用于基层实验室和出入境检疫对海洋双RNA病毒属的疫情监测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 核酸恒温扩增技术的分类和原理
• 1.1.1 NASBA法
• 1.1.2 SDA法
• 1.1.3 HDA法
• 1.1.4 RCA法
• 1.1.5 LAMP法
• 1.2 LAMP技术与其他恒温扩增技术相比的优势
• 1.3 LAMP技术的应用
• 1.3.1 定量分析扩增产物
• 1.3.2 在病原微生物检测中的应用
• 1.3.3 其它方面的应用
• 1.3.4 LAMP技术的展望
• 1.4 LAMP技术在水生动物疾病检测的应用现状
• 1.4.1 水生动物病原微生物的检测
• 1.4.2 展望
• 第二章 淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.1.3 DNA提取
• 2.1.4 引物的设计
• 2.1.5 LAMP反应体系优化及扩增产物检测方法
• 2.1.6 特异性分析
• 2.1.7 灵敏度分析
• 2.1.8 扩大试验
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 LAMP的反应体系优化结果
• 2.2.2 特异性实验结果
• 2.2.3 LAMP与常规PCR和实时定量PCR检测限的比较
• 2.2.4 扩大试验结果
• 2.3 讨论
• 第三章 海洋双RNA病毒反转录环介导等温扩增检测方法的建立与应用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.1.3 引物设计
• 3.1.4 RT-LAMP反应体系优化及扩增产物的检测
• 3.1.5 特异性分析
• 3.1.6 灵敏度分析
• 3.1.7 扩大试验
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 RT-LAMP的反应体系优化结果
• 3.2.2 特异性实验结果
• 3.2.3 LAMP与常规PCR和实时定量PCR检测限的比较
• 3.2.4 扩大试验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢