论文摘要
目的肌肉素（Musclin）是Nishizawa H.于2004年用信号序列示踪的方法从小鼠骨骼肌首先提取并鉴定的一种生物活性因子,并降低分化的C2C12成肌细胞葡萄糖摄取。因此Musclin可能参与胰岛素抵抗（IR）。IR在人类普遍存在,特别是大多数2型糖尿病（T2DM）患者及肥胖者均可见IR。25%糖耐量正常者及25%的老年人身上亦可见IR。除此之外,即使在正常生理情况下,也会发生IR,如妊娠。因此,探讨IR发生机制是最终可能控制和改善IR的最根本途径。以往对IR的研究大多是围绕着靶器官及其胰岛素受体进行的,近年来,随着对脂肪组织这一内分泌器官的逐渐认识,人们发现脂肪组织内分泌功能失调是连接肥胖、IR和糖尿病间的重要桥梁。而脂肪细胞源因子,如瘦素（leptin）,抵抗素（resistin）,脂联素（adiponectin）等表达异常是参与或加重IR及损伤β细胞功能从而诱发糖尿病的重要的分子机制。作为最大的胰岛素敏感组织,骨骼肌参于健康人至少90%的胰岛素刺激葡萄糖处置。因此,Musclin的发现,势必使人们对IR有更加深入的了解。IR表现为靶器官,如肝脏、肌肉、脂肪组织等对胰岛素介导的葡萄糖代谢作用不敏感。葡萄糖摄取的分子水平研究主要集中在葡萄糖转运体及胰岛素信号转导通路。其中,骨骼肌中的葡萄糖转运体研究最多的是葡萄糖转运体4（GLUT4）,在没有胰岛素刺激时主要位于细胞内的贮存囊泡内。当胰岛素与受体结合后,激发一系列级联效应,导致富含GLUT4的囊泡向细胞外膜移动,囊泡膜与细胞外膜融合,GLUT4转位至细胞外膜且活性增加,与葡萄糖结合并发生结构改变,将葡萄糖转运至细胞内后恢复原来结构。T2DM的一个重要病理特征是对胰岛素刺激的葡萄糖摄取的抵抗。由于上述过程是由位于细胞外膜上的GLUT4介导,因此GLUT4被认为对IR起着关键的作用;胰岛素信号转导通路研究最多的是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）途径。PI3K是细胞内具有信号转导和分子开关功能的多肽类物质,蛋白激酶B（AKT/PKB）是其下游效应分子。PI3K磷酸化激活后激活AKT/PKB,从而启动骨骼肌中的胰岛素信号转导通路,影响GLUT4mRNA的合成,胞浆中高尔基体相应蛋白质的合成,胞浆运输及细胞膜转位,进而影响葡萄糖的摄取。PPARγ是参与葡萄糖代谢的细胞核受体因子,与其下游因子LXRα通过亚基相连。Dalen等证实GLUT4基因受核因子肝X受体（liver X receptors,LXRs）α（LXRα）调控;LXRα调控GLUT4基因启动子区域的一个保守序列,即DR-4反应元件（GLUT4LXRE）,从而提高外周组织对葡萄糖的摄取。上述细胞因子是否参与Musclin对大鼠分化的成肌细胞葡萄糖的摄取,如何参与等尚未清楚,特别是国内未见报道。本研究通过对大鼠的一系列实验来探讨Musclin对肌细胞在葡萄糖摄取及其环节中的影响,并拟用PPARγ激动剂噻唑烷二酮类（TZD）药物家族成员-罗格列酮来观察PPARγ在Musclin引起IR效应中的作用,旨在从分子生物学水平探讨Musclin对肌细胞在葡萄糖摄取及其环节中的作用。方法一、大鼠成肌细胞提取、培养及诱导分化1、大鼠成肌细胞提取取SD大鼠180-200g,予10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉,8%硫化钡脱去腹部及双下肢鼠毛,75%乙醇消毒两次。自下腹正中剪开皮肤,向左右钝性分离暴露胫骨前肌,用眼科剪剪下胫骨前肌,称重后用含双抗（青霉素和链霉素）的PBS冲洗两次,放入10cm培养皿,先用眼科剪,再用纤维外科剪平行肌纤维剪成1mm3小块,37℃条件下,用0.5mg/ml胶原酶消化组织块1小时后,用孔径为100μm的呢龙网将上清液滤入20ml离心管,轻轻摇晃并吹打上清液,使细胞混悬。离心（1000g,10分钟）,吸去上清液,加入10ml含10%胎牛血清的DMEM培养基,用移液器轻微混悬细胞,然后,用血细胞计数板计数细胞。用生长培养液稀释细胞悬液,以约1.5×106个/ml的细胞密度将细胞接种于250 ml培养瓶,将培养瓶移入湿润的培养箱,在37℃和5%CO2条件下培养细胞。2.大鼠成肌细胞原代培养将提取到的成肌细胞用含10%胎牛血清和100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基在37℃,5%CO2的条件下湿润的培养箱中饱和湿度培养细胞,于接种24小时轻微更换培养液,用含0.25%胰蛋白酶消化液消化,加入PBS轻微冲洗2次后,轻轻摇晃并吹打上清液,使细胞混悬。离心（1000g,10分钟）,吸去上清液,加入10ml含10%胎牛血清的DMEM培养基,用带有1000 ml枪头的1000 ml移液器轻微混悬细胞,然后,用玻璃吸管吸取单个细胞加入96孔板。待细胞长到大于50个克隆,用含0.25%胰蛋白酶消化液消化,冲洗,离心后,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,用移液器轻微混悬细胞,接种于24孔板。以后每2-3天换液一次。待细胞处于80-90%融合状态时,用含0.25%胰蛋白酶消化液消化传代,血细胞计数板计数细胞。接种于培养瓶,将培养瓶移入湿润的培养箱,在37℃和5%CO2条件下培养细胞。以后每2-3天换液一次。待细胞处于80-90%融合状态时,用含0.25%胰蛋白酶消化液消化传代;待细胞生长至80-90%时更换分化培养液。3.大鼠成肌细胞免疫组化鉴定生长至80-90%融合状态的大鼠P2成肌细胞处于80-90%融合状态时移去生长培养基,用PBS清洗一次;用10%的甲醛溶液或者4%的多聚甲醛PBS在室温固定20分钟;PBS漂洗三次后;在室温下用含10%正常羊血清（10%NGS）的PBS封闭1小时;在37℃用MyoD兔抗大鼠多克隆抗体4℃孵育过夜;用含0.1%Tween-20的PBS在室温漂洗三次;37℃用山羊抗兔多克隆抗体孵育半小时;DAB显色。倒置相差显微镜照相记录染色情况。4.大鼠成肌细胞诱导分化生长至80-90%融合状态的大鼠P3成肌细胞用含2%的胎牛血清和100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基在37℃,5%CO2条件下湿润的培养箱中饱和湿度培养细胞,以后每2-3天换液一次。5天后改换1%胎牛血清和100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基在37℃,5%CO2条件下湿润的培养箱中饱和湿度继续培养细胞,待细胞处于80-90%融合状态时用于实验。5.大鼠成肌细胞诱导分化为骨骼肌细胞铁苏木素染色鉴定生长至80-90%融合状态的上述大鼠P3成肌细胞继续用含1%的胎牛血清和100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基在37℃,5%CO2条件下湿润的培养箱中饱和湿度培养7天后,弃去培养基,用40℃蒸馏水冲洗1次,10%福尔马林固定30分钟,蒸馏水冲洗3次,2.5%铁明矾室温下浸染30分钟;2.5%铁明矾+10%苏木素浸染40分钟,蒸馏水再次冲洗3次,2.5%铁明矾浸染2分钟,蒸馏水再次冲洗3次。加蒸馏水4ml,将染色后的细胞置于倒置相差显微镜下照相记录染色情况。二、实验分组1、不同葡萄糖浓度时,Musclin对胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞3氚标记-葡萄糖（3H-G）摄取的影响A、5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素;B、25mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素;C、5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素+0.5μg/ml Musclin;D、25mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素+0.5μg/ml Musclin。2、25mmol/l葡萄糖浓度下Musclin对大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取的影响及其分子机制的实验研究A、25mmol/l葡萄糖;B、25mmol/l葡萄糖+0.5μg/ml Musclin;C、25mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素;D、25mmol/l葡萄糖+0.5μg/ml Musclin+10mU/ml胰岛素。3、罗格列酮对Musclin抑制大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取的影响及其分子机制的实验研究A.（对照组）25mmol/l葡萄糖;B.25mmol/l葡萄糖+0.5μg/ml Musclin;C.25mmol/l葡萄糖+0.5μg/ml Musclin+0.4μg/ml Rosiglitazone;D.25mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素.E.25mmol/l葡萄糖+0.5μg/ml Musclin+10mU/ml胰岛素;F.25mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素+0.5μg/ml Musclin+0.4μg/ml Rosiglitazone+10mU/ml胰岛素。三、检测指标与方法1、成肌细胞鉴定采用免疫组化法;2、成肌细胞诱导分化为骨骼肌细胞鉴定采用铁苏木素染色法;3、萄糖摄取采用同位素示踪法;4、RT-PCR法检测PI3K,AKT/PKB,PPARγ,LXRα和GLUT4 mRNA的表达;5、Western Blot法检测AKT/PKB和pAKT/PKB的表达。四、统计学处理所有数据用SPSS 12.0软件处理。全部计量资料用均数±标准差（（?）±s）表示,不同组间分析采用方差分析（ANOVA）检验,有显著意义后用最小有意义差异t检验进行均数间的多重比较,以P＜0.05为统计学上有显著差异。结果一、Musclin对大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取的影响研究1、成肌细胞培养、诱导分化及鉴定成肌细胞克隆样生长,融合成多个核的肌管,是肌卫细胞鉴定的关键指标。本实验以诱导分化后成肌细胞融合形成肌管为诱导分化成功。2、25mmol/l葡萄糖浓度时,Musclin抑制胰岛素诱导分化的大鼠成肌细胞3H-G的摄取与对照组（A组）比较,Musclin干预组（B组）成肌细胞对葡萄糖的摄取量显著减少（P＜0.05）;与B组比较,Musclin与胰岛素共干预组（D组）成肌细胞对葡萄糖的摄取量明显增加（P＜0.05）。A组与5mmol/l葡萄糖、Musclin与胰岛素共干预组（C组）比较,成肌细胞对葡萄糖的摄取量无明显改变（P＞0.05）。二、25mmol/l葡萄糖浓度下Musclin对大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取的影响及其分子机制的实验研究1、成肌细胞培养、诱导分化及鉴定此部分结果同实验一。2、25mmol/l葡萄糖浓度Musclin抑制胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞3H-G的摄取与对照组（A组）比较,Musclin干预组（B组）成肌细胞对葡萄糖的摄取量显著减少（P＜0.05）;与B组比较,Musclin与胰岛素共干预组（D组）成肌细胞对葡萄糖的摄取量明显增加（P＜0.05）。3、25mmol/l葡萄糖浓度时Musclin抑制胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取过程中PI3K,AKT/PKB,PPARγ,LXRα和GLUT4mRNA的表达与对照组（A组）比较,Musclin干预组（B组）PI3K,AKT/PKB,PPARγ和LXRαmRNA的表达水平均显著降低（P＜0.05）;与B组比较,Musclin与胰岛素共干预组（D组）PI3K,AKT/PKB,PPARγ和LXRαmRNA的表达水平均显著升高（P＜0.05）;但4组GLUT4mRNA的表达水平均无明显变化（P＞0.05）。4、Musclin抑制胰岛素诱导分化的成肌细胞葡萄糖摄取过程中AKT/PKB蛋白的表达与对照组（A组）比较,Musclin干预组（B组）AKT/PKB和pAKT/PKB的蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）;与B组相比,Musclin与胰岛素共干预组（D组）AKT/PKB和pAKT/PKB的蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。三、罗格列酮对Musclin抑制大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取的影响及其分子机制的实验研究1、成肌细胞培养、诱导分化及鉴定此部分结果同实验一。2、25mmol/l葡萄糖浓度下,罗格列酮改善Musclin抑制胰岛素诱导分化的成肌细胞3H-G的摄取与对照组（A组）比较,Musclin干预组（B组）成肌细胞对葡萄糖的摄取量明显减少（P＜0.05）;与B组比较,Musclin与罗格列酮共干预组（C组）成肌细胞对葡萄糖的摄取量明显增加（P＜0.05）;Musclin、罗格列酮与胰岛素共干预组（F组）成肌细胞对葡萄糖的摄取量显著增加（P＜0.01）。3、25mmol/l葡萄糖浓度下,罗格列酮对Musclin抑制胰岛素诱导分化的成肌细胞葡萄糖摄取过程中PI3K,AKT/PKB,PPARγ,LXRα和GLUT4mRNA表达的影响与对照组（A组）比较,Musclin干预组（B组）PI3K,AKT/PKB,PPARγ和LXRαmRNA的表达水平均显著降低（P＜0.05）;Musclin、罗格列酮与胰岛素共干预组（F组）PI3K,AKT/PKB,PPARγ和LXRαmRNA的表达水平均显著升高（P＜0.05）。但6组GLUT4mRNA的表达水平均无明显变化（P＞0.05）。4、25mmol/l葡萄糖浓度时,罗格列酮改善Musclin抑制胰岛素诱导分化的成肌细胞葡萄糖摄取过程中AKT/PKB蛋白的表达与对照组（A组）比较,Musclin干预组（B组）AKT/PKB和pAKT/PKB的蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）;与B组比较,Musclin、罗格列酮与胰岛素共干预组（F组）AKT/PKB和pAKT/PKB的蛋白表达水平均显著升高（ΔP＜0.05）。结论1、25mmol/l葡萄糖浓度下,Musclin抑制胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取。2、25mmol/l葡萄糖浓度下,Musclin抑制胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取过程不是通过影响GLUT4mRNA的表达;而是通过抑制成肌细胞胰岛素信号转导通路中PI3K/AKT（PKB）的mRNA表达及AKT/PKB的蛋白活性;抑制核因子PPARγ、LXRα的mRNA表达来实现的。3、罗格列酮（RSG）能够改善25mmol/l葡萄糖浓度下Musclin抑制胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞葡萄糖摄取;其作用也与改善胰岛素信号转导通路中的PI3K/AKT（PKB）及核因子PPARγ、LXRα有关。
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