论文摘要
近十年来,蛋白质合理设计(Protein rational design)这项蛋白质改造技术得到长足的发展.这都是基于目前人们对酶蛋白结构有良好认知。人们通过蛋白质工程的方法对蛋白质进行改造,使其获得新的功能。这种方法较之先前基于非理性设计思想的定向进化(directed evolution)技术来,能更快捷地获得期望的酶蛋白。我们实验室在之前的工作中,已经分别开展了对来自于嗜热古菌Aeropyrum pernix K1的嗜热酯酶ape1547和来自于Sulfolobus Tokodaii strain 7T(JCM 10545)的酰基肽释放st0779的分子进化机制进行了研究。通过对序列以及结构进行分析之后,我们发现ape1547和st0779有着极相似的催化结构域,但是ape1547与st0779的推进器结构域的差别较大,而且它们的底物特异性差距更是惊人。所以我们才产生一个设想,将ape1547的推进器结构域转移至st0779的催化结构域,期望能产生有趣的现象。因此我们首先通过计算机辅助的手段确认了我们关于设计方案中重组酶的稳定性。在70度高温环境下对重组酶AS执行分子动力学500ps模拟后与起始构象相比主链的RMSD值小于2,可见重组酶AS在实际水环境其热稳定性很高。而实验证明,重组酶AS在酶学性质上表现跟我们之前设想的一样,不光在酶活力上发生巨大的改变,而且在酶底物特异性和酶热稳定性也发生剧烈变化。与ST相比,无论在肽酶和酯酶底物,它们最适底物活性都有所提高,专一性大幅提高。以pNPC3为例,它是AS和st0779最适脂质底物,而AS对pNPC3催化活力相比st0779提高了1.58倍。而热稳定性更比st0779高了10度。综上我们获得以下启发意义：一,具有不同功能的肽段确实可作为“结构模块”(building blocks)或者是“功能模块”(function blocks)在同源性低但三级结构上相似的蛋白质之间“移植”以获得期望的新功能。这很可能是蛋白质分子的某种非常重要的进化机制：向具有“底物非专一性”的原始酶模块上引入不同的肽段将会带来不同的功能,从而形成全新功能的蛋白质超家族。随后,通过发生在一级序列上的氨基酸残基突变对家族内部各成员间进行“调整”,从而导致新的趋异进化(divergent evolution)的产生；二,具有“非专一性”的酶确实可以作为一类酶分子进化或改造的原始酶。在选择好恰当的可进行蛋白质改造的起始酶后,在合理设计思想的指导下,将基于点突变的定向进化技术与蛋白质结构元件重组技术相结合,必将加快我们改造蛋白质的步伐,从而大大丰富了人们可以利用的优质酶/蛋白质的来源。
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标签：蛋白质合理化设计论文; 底物选择性论文; 重组酶论文; 模块酶论文;