记忆缺失性贝毒免疫胶体金快速检测试纸条的研制

论文摘要

记忆缺失性贝毒（ASP）是有毒赤潮硅藻分泌产生的毒素，其主要活性成分软骨藻酸（domic acid, DA）是一种氨基酸类毒素。海洋贝类通过食物链的传递作用可在体内累积DA，人及海洋哺乳动物中毒之后，会干扰中枢神经系统，发生暂时性失去记忆甚至死亡。胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatographic assay,GICA）是以条状纤维层析材料为固相载体，通过毛细管作用原理，以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型检测方法。该方法具有操作简单、快速、分析结果易于判断，无需任何仪器、成本低廉等优点，适用于现场批量检测。近年来，胶体金免疫层析技术己成为当今发展最快速的免疫学检测技术之一，在毒素检测等领域得到了广泛的发展。本研究采用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术，制备快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条。取得了如下研究成果：1.软骨藻酸免疫抗原和包被抗原的制备采用活泼酯法，将软骨藻酸与载体蛋白钼孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）进行偶联，制备了相应的免疫抗原DA-KLH和包被抗原DA-BSA，紫外扫描定性鉴定偶联成功，偶联比分别为1:25和1:16。2.软骨藻酸单克隆抗体的制备免疫抗原DA-KLH免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤细胞融合技术成功制备2株能稳定分泌抗软骨藻酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，抗体亚类分别为IgG1和IgG2a，通过体内诱生腹水法获得纯化后效价为1：64000的抗软骨藻酸单克隆抗体。3.胶体金及软骨藻酸金标抗体的制备采用柠檬酸三钠还原氯金酸法，成功确立了20nm胶体金的制备条件，并利用制备好的胶体金，对前述制备的抗软骨藻酸单克隆抗体进行了胶体金标记条件的摸索，成功确立了单克隆抗体的胶体金标记条件：最适pH是9.0，最适标记稳定量是9.72μg/mL胶体金，并制备金标抗体。4.软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备对软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的各项指标进行优化，并确立了最佳条件。最终选择SB06玻璃纤维素膜涂布4×稀释度的金标抗体构成胶体金结合垫；选择Millipore180 NC膜作为层析膜，羊抗鼠IgG（1mg/mL）和1μL包被抗原DA-BSA（0.867 mg/mL）喷涂在NC膜上，分别作为质控线和检测线；选用SB08玻璃纤维素膜作为样品垫；SX18吸水纸作为吸收垫；将胶体金结合垫、NC膜、样品垫和吸收垫组装成软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条5.软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的应用对胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度、特异性和稳定性进行测试，结果表明，试纸条检测时间不超过15 min，检测灵敏度达20 ng/mL（对于贝类食品相当于8μg/g贝肉），可以满足国际规定的20μg/g的安全限值。特异性强、重复性好，4℃下可保存6个月。该方法灵敏度高、简单快速，无需特殊仪器设备，适用于广大基层单位的现场和批量检测，有着良好的商业开发应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 记忆缺失性贝毒研究进展
• 1.1.1 赤潮
• 1.1.2 赤潮毒素
• 1.1.3 记忆缺失性贝毒（amnesic shellfish poisoning, ASP）——软骨藻酸
• 1.2 软骨藻酸的检测技术
• 1.2.1 小鼠生物分析法
• 1.2.2 高效液相色谱法
• 1.2.3 毛细管电泳法
• 1.2.4 酶联免疫分析法
• 1.3 胶体金免疫层析技术及其应用
• 1.3.1 胶体金的性质与特点
• 1.3.2 胶体金的制备
• 1.3.3 胶体金标记抗体
• 1.3.4 胶体金免疫层析技术
• 1.3.5 胶体金免疫层析试纸条的结构与检测原理
• 1.4 胶体金免疫层析技术在赤潮毒素检测中的应用
• 1.5 课题来源、意义及研究内容
• 1.5.1 课题来源
• 1.5.2 研究意义
• 1.5.3 研究目的与研究内容
• 1.5.4 技术路线
• 第二章 抗软骨藻酸单克隆抗体的制备
• 2.1 实验仪器与材料
• 2.1.1 药品与试剂
• 2.1.2 溶液系统
• 2.1.3 实验动物和细胞
• 2.1.4 主要仪器及耗材
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 软骨藻酸人工抗原的合成
• 2.2.2 软骨藻酸单克隆抗体的制备
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 软骨藻酸人工抗原的合成与鉴定
• 2.3.2 免疫小鼠血清效价
• 2.3.3 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选
• 2.3.4 单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定
• 2.3.5 单克隆抗体效价测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 软骨藻酸人工抗原的合成与鉴定
• 2.4.2 免疫小鼠血清效价
• 2.4.3 细胞融合
• 2.4.4 单克隆抗体亚型鉴定
• 2.5 本章小结
• 第三章 胶体金及软骨藻酸金标抗体的制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 药品与试剂
• 3.1.2 溶液系统
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 玻璃器皿的清洁
• 3.2.2 胶体金的制备
• 3.2.3 胶体金的质量鉴定
• 3.2.4 金标抗体的制备与纯化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 胶体金质量鉴定
• 3.3.2 金标抗体的制备与纯化
• 3.4 讨论
• 3.4.1 胶体金的制备
• 3.4.2 胶体金粒径的选择
• 3.4.3 金标抗体的制备与纯化
• 3.5 本章小结
• 第四章 软骨藻酸胶体金检测试纸条的组装与初步应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 药品与试剂
• 4.1.2 贝类样品
• 4.1.3 溶液系统
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 试纸条材料
• 4.2 实验方法与步骤
• 4.2.1 金标单抗吸附于玻璃纤维
• 4.2.2 NC 膜包被抗原和二抗
• 4.2.3 样品垫的选择
• 4.2.4 吸收垫的选择
• 4.2.5 胶体金试纸条的组装
• 4.2.6 试纸条评价标准
• 4.2.7 试纸条性能测试
• 4.2.8 贝类样品中软骨藻酸的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 金标单抗吸附于玻璃纤维
• 4.3.2 NC 膜包被抗原和二抗
• 4.3.3 样品垫的选择
• 4.3.4 吸收垫的选择
• 4.3.5 胶体金试纸条的组装与测试
• 4.3.6 试纸条性能测试
• 4.3.7 贝类样品中软骨藻酸的测定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 建立胶体金免疫层析快速检测技术的关键因素
• 4.4.2 金标抗体吸附玻璃纤维
• 4.4.3 NC 膜包被抗原和二抗
• 4.4.4 样品垫处理液的选择
• 4.4.5 试纸条假性
• 4.4.6 试纸条特点及改进方向
• 4.4.7 试纸条发展前景
• 4.5 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 缩略词表
• 论文发表情况
• 致谢