免疫分子CD154对猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的免疫增强作用研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病，主要导致妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪的大量死亡。该病自从1987年在美国首次报导以来，现已遍及世界各主要养猪国家，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。由ORF5基因编码的GP5蛋白是PRRSV最主要的结构蛋白和免疫原性蛋白之一，并能诱发最强的中和抗体，是研制PRRS新型疫苗的良好靶蛋白，但以天然ORF5基因构建的多种新型疫苗均难以诱发较早和较高水平的抗体，特别是保护性的中和抗体。CD154分子是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，为肿瘤坏死因数超家族（TNRF）成员，其表达谱广泛，主要表达于CD4+T细胞表面，也表达在其它T细胞，如CD8+或CD45RO+／CD45RA+T细胞、Tc1／Tc2细胞或B细胞表面。CD154与CD40分子之间相互作用与T淋巴细胞和B淋巴细胞活化、增殖、抗体产生、生发中心形成有关，近年有研究表明，CD154与疫苗联合运用能显著增强疫苗免疫效果。本研究以PRRSV ORF5基因为靶基因，构建了与CD154基因融合表达和共表达的ORF5基因核酸疫苗，探讨了CD154基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的免疫增强作用。具体研究内容如下：1、猪CD154基因的克隆及其在大肠杆菌及真核细胞中的表达利用RT-PCR方法从湖北白猪外周血单核细胞中分离克隆猪CD154基因的完整编码区，进一步PCR扩增获得缺失信号肽（1-22aa）和跨膜区（23-46aa）的基因片段tCD154，将其克隆至原核表达载体pQE-80L的6×His下游，获得原核表达质粒pQE-tCD154，转化大肠杆菌DH5α诱导表达出分子量约29kD的融合表达蛋白6×His-tCD154，Western-blot证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。同时，将完整CD154基因克隆至真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游，获得融合表达质粒pEGFP-C1-CD154，转染Hela细胞，荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白的表达主要定位于细胞膜，表明猪CD154是一种膜蛋白。2、猪CD154基因与PRRSV ORF5基因共表达和融合表达DNA疫苗的构建及其免疫效果以PRRSV ORF5基因为目标基因，以pCI-neo为载体，构建两种不同的DNA疫苗：第一种为猪CD154基因与PRRSV ORF5基因共表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154，第二种为猪CD154基因与PRRSV ORF5基因融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5n60-tCD154，比较两种疫苗与单独表达ORF5基因的PRRSV DNA疫苗pCI-ORF5的免疫效果差别。间接免疫荧光证实两种质粒在体外培养的HeLa细胞中均可正确表达GP5蛋白，与抗PRRSV的高免猪血清具有特异性反应。小鼠免疫试验结果表明，与猪CD154共表达或融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154、pCI-ORF5n60-tCD154诱导的抗GP5蛋白ELISA抗体和淋巴细胞增殖反应均明显优于单独表达ORF5的DNA疫苗pCI-ORF5，而且以与CD154共表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154效果最好，说明猪CD154基因对PRRSV ORF5 DNA疫苗具有免疫增强作用，CD154是一种极具应用前景的免疫增强分子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征
• 1.1.1 PRRS的危害及流行病学特点
• 1.1.2 PRRSV分类
• 1.1.3 PRRSV理化特性
• 1.1.4 PRRSV抗原性
• 1.1.5 PRRSV分子生物学研究进展
• 1.1.6 PRRSV的基因组变异和RNA重组
• 1.1.7 PRRSV的免疫学反应
• 1.1.8 PRRS疫苗研究进展
• 1.2 CD154
• 1.2.1 CD154基因及蛋白结构
• 1.2.2 CD154生物学特性
• 1.2.3 CD154生物学功能
• 1.2.4 CD154在疾病治疗中的应用
• 第2章 研究的目的与意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细胞、毒株、试验动物
• 3.1.2 质粒、载体
• 3.1.3 本研究中所用的寡核苷酸引物
• 3.1.4 工具酶及主要试剂
• 3.1.5 反应试验所用抗原及血清
• 3.1.6 培养基及主要试剂的配制
• 3.1.7 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 猪外周血单核细胞（PBMC）的分离及培养
• 3.2.2 猪淋巴细胞RNA的提取
• 3.2.3 CD154基因的RT-PCR扩增与检测
• 3.2.4 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.6 线性质粒DNA末端去磷酸化
• 3.2.7 PCR产物或酶切产物回收与纯化
• 3.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.10 连接产物的转化
• 3.2.11 质粒的小量制备（碱裂解法）
• 3.2.12 质粒的大量制备（碱裂解法）
• 3.2.13 质粒DNA含量的测定
• 3.2.14 重组质粒（阳性质粒）的鉴定
• 3.2.15 质粒转染（脂质体介导转染法）
• 3.2.16 诱导表达
• 3.2.17 用于SDS-PAGE电泳的包涵体提取
• 3.2.18 用于ELISA抗原的包涵体的提取
• 3.2.19 ELISA最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定（方阵滴定）
• 3.2.20 Western blot检测目的蛋白的体外表达
• 3.2.21 多克隆抗体制备
• 3.2.22 间接免疫荧光试验（IFA）
• 3.2.23 间接ELISA试验
• 3.2.24 动物试验
• 3.2.25 细胞免疫的检测
• 3.2.26 统计学方法
• 第4章 结果与分析
• 4.1 猪CD154基因原核及真核表达质粒的构建与体外表达检测
• 4.1.1 猪CD154全长基因RT-PCR扩增与克隆
• 4.1.2 CD154基因缺失突变体的PCR扩增
• 4.1.3 原核表达质粒pQE80-tCD154的构建及鉴定
• 4.1.4 CD154基因在大肠杆菌中的表达
• 4.1.5 Western-blot检测
• 4.1.6 真核表达质粒的构建及鉴定
• 4.1.7 真核表达质粒在HeLa细胞中的表达与细胞定位
• 4.1.8 CD154多抗的制备
• 4.2 PRRSV ORF5基因与猪CD154基因共表达及融合表达质粒的构建与体外表达检测
• 4.2.1 PRRSV ORF5基因与猪CD154基因共表达质粒的构建
• 4.2.2 PRRSV ORF5n60与猪CD154基因缺失突变体融合表达质粒的构建
• 4.2.3 间接免疫荧光（IFA）检测ORF5基因的表达
• 4.3 PRRSV ORF5基因与猪CD154基因共表达及融合表达DNA疫苗诱导小鼠免疫反应结果
• 4.3.1 免疫小鼠的ELISA抗体水平
• 4.3.2 免疫小鼠诱导的T细胞增殖反应比较
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 PRRS新型疫苗靶基因的选择
• 5.1.2 优良免疫佐剂的选择
• 5.1.3 猪CD154基因及ORF5基因的克隆、鉴定及序列分析
• 5.1.4 猪CD154基因的原核表达、蛋白活性检测
• 5.1.5 猪CD154蛋白在细胞中的定位
• 5.1.6 真核表达载体的选择
• 5.1.7 融合表达疫苗中ORF5基因缺失突变体的选择
• 5.1.8 猪CD154与ORF5基因融合表达和共表达PRRSV DNA疫苗诱导的免疫反应
• 5.1.9 PRRS新型疫苗的发展前景
• 5.2 结论
• 致谢
• 附录