农杆菌介导哈茨木霉转化系统优化及突变体分析

论文摘要

哈茨木霉是一种重要的生防真菌,从基因水平研究木霉菌关键基因的功能,可以加速对其生长、生防、产孢机理的认识,为开发高效、稳定的生防制剂提供理论依据。利用分子标签技术获得突变子己成为功能基因克隆的有效方法,农杆菌介导的真菌遗传转化是当前获得突变子的最优方法之一。因此,本论文进行了农杆菌介导哈茨木霉转化体系研究,初步构建了哈茨木霉T-DNA插入突变体库,对突变子进行系统分析,取得如下结果:1.农杆菌介导哈茨木霉转化系统的优化及T-DNA插入突变体库构建针对转化过程中8个关键因素对农杆菌介导哈茨木霉转化效率的影响建立了高效的哈茨木霉转化体系:IM培养基中AS浓度为200μM,农杆菌诱导时间为6h,农杆菌菌液浓缩45倍与浓度为106个/mL的木霉孢子悬液等体积混合,400μL混合液涂布到含200μM AS、pH为5.3、铺有滤纸的共培养基上,24℃共培养48h。在该转化条件下农杆菌EHA105对哈茨木霉的转化效率为60150个转化子/106个孢子。利用该转化系统构建了含有4500株转化子的突变体库,库中的转化子遗传稳定性高、转化子基因组中T-DNA插入拷贝数为13个,其中80%为随机单拷贝插入。2.哈茨木霉孢子产生突变子的筛选和分析采用PDA培养基、CHM培养基和PD培养基分别对突变体库中的920株、2680株和1192株转化子进行孢子产生突变体的筛选。利用PDA培养基筛选出8株孢子产生突变子,这些突变子与野生型哈茨木霉菌株相比,在孢子产生数量、菌落形态、分生孢子梗形态等方面发生了变异;利用CHM培养基筛选出4株厚垣孢子产生减少的突变子、3株厚垣孢子产生减少同时分生孢子产生增多的突变子;利用PD培养基筛选出12株孢子产生突变子,其中5株分生孢子产生减少,菌丝上没有厚垣孢子分化,另外7株分生孢子产生减少、菌丝上有厚垣孢子分化。3.哈茨木霉生长速度变异突变子和拮抗能力变异突变子的筛选和分析测定600株转化子在PDA培养基上的生长速度,得到3株生长速度降低的突变子,4株生长速度增加的突变子。测定1260株转化子对立枯丝核菌的拮抗能力,发现T-DNA插入对部分转化子的拮抗能力产生了明显影响,其中6株转化子拮抗作用增强,17株拮抗作用减弱。4.哈茨木霉T-DNA插入侧翼序列分析测定52株突变子右边界侧翼序列,得到42条可解析序列,其中7条为质粒序列、33条对应着单一序列、另外2条序列相同。34条序列进行分析发现,T-DNA插入过程中右边界序列存在一定程度的截短现象。另外,对34条序列的G+C%进行分析,其中92%的序列G+C%在4456%之间（平均52.4%）。这与NCBI已公布的哈茨木霉EST序列G+C%含量相似,推断T-DNA插入到了哈茨木霉基因区。5.孢子产生突变子相关基因的克隆与序列分析利用TAIL-PCR方法对孢子产生突变子T-DNA右边界侧翼序列进行克隆,得到9条有效序列,将这些序列在Genbank中进行比对分析,发现有6株转化子的T-DNA右边界侧翼序列与已知基因具有同源性,推断了相关序列的功能。而其余3株转化子的侧翼序列没有找到同源基因,对其进一步分析有可能找到与孢子产生相关的新基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 木霉在生物防治中的应用
• 1.1.1 木霉菌的拮抗机制
• 1.1.2 木霉菌的拮抗范围
• 1.1.3 木霉制剂的种类
• 1.2 木霉功能基因的研究
• 1.3 功能基因的研究方法
• 1.3.1 正向遗传学方法
• 1.3.2 反向遗传学方法
• 1.4 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展
• 1.4.1 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的分子基础
• 1.4.2 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的过程
• 1.4.3 影响农杆菌介导的丝状真菌遗传转化效率的因素
• 1.4.4 农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的特点
• 1.4.5 农杆菌介导的丝状真菌遗传转化在真菌功能基因研究中的应用
• 1.4.6 常用的选择性标记
• 1.4.7 标签基因的分离方法
• 1.5 本研究的目的意义及技术路线
• 1.5.1 本研究的目的意义
• 1.5.2 本研究的主要内容
• 1.5.3 本研究的技术路线
• 第二章 农杆菌介导的哈茨木霉转化系统的优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 供试培养基
• 2.1.3 引物和主要试剂
• 2.1.4 实验菌株保存方法
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 筛选转化子所需潮霉素B 浓度的确定
• 2.2.2 抑制农杆菌生长所需头孢霉素浓度的确定
• 2.2.3 农杆菌EHA105 的活化和诱导培养
• 2.2.4 哈茨木霉Th-33 分生孢子的培养
• 2.2.5 农杆菌转化哈茨木霉的具体步骤
• 2.2.6 假定转化子的遗传稳定性分析
• 2.2.7 木霉菌丝体的培养和收集
• 2.2.8 木霉基因组DNA 的提取
• 2.2.9 假定转化子的T-DNA 插入的PCR 检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 筛选转化子所需潮霉素B 浓度的确定
• 2.3.2 抑制农杆菌生长所需头孢霉素浓度的确定
• 2.3.3 农杆菌转化哈茨木霉的初步研究
• 2.3.4 农杆菌介导的哈茨木霉转化体系的优化
• 2.3.5 利用农杆菌进行其他木霉菌的转化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 转化过程中存在的假阳性问题
• 2.4.2 关于转化过程的优化
• 2.4.3 转化受体对转化系统的要求及对转化效率的影响
• 第三章 哈茨木霉T-DNA 插入突变体库质量的评价
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 供试培养基及用途
• 3.1.3 供试试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 哈茨木霉转化子的遗传稳定性分析
• 3.2.2 哈茨木霉及转化子菌丝体的培养和收集
• 3.2.3 哈茨木霉及转化子基因组DNA 的提取
• 3.2.4 农杆菌EHA105 的培养
• 3.2.5 农杆菌EHA105 质粒DNA 的提取
• 3.2.6 DNA 质量的检测
• 3.2.7 T-DNA 插入的PCR 检测
• 3.2.8 T-DNA 插入的Southern 杂交检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 哈茨木霉转化子的遗传稳定性分析
• 3.3.2 哈茨木霉转化子T-DNA 插入的PCR 检测
• 3.3.3 哈茨木霉转化子T-DNA 插入的Southern 杂交检测
• 3.4 讨论
• 第四章 哈茨木霉突变体库中不同性状突变子的筛选和评价
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 实验培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 哈茨木霉T-DNA 插入突变体库中孢子产生突变株的筛选
• 4.2.2 哈茨木霉T-DNA 插入突变体库中菌落生长速度突变株的筛选
• 4.2.3 哈茨木霉T-DNA 插入突变体库中拮抗能力变异突变株的筛选
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 利用PDA 培养基进行哈茨木霉孢子产生突变子的筛选
• 4.3.2 利用CHM 培养基进行哈茨木霉孢子产生突变子的筛选
• 4.3.3 利用PD 培养基进行哈茨木霉孢子产生突变子的筛选
• 4.3.4 菌落生长速度变异突变子的筛选
• 4.3.5 拮抗能力变异突变子的筛选
• 4.4 讨论
• 第五章 T-DNA 在哈茨木霉中的整合特点及孢子产生突变子T-DNA 侧翼序列的分析
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 TAIL-PCR 实验所需的随机简并引物和特异引物
• 5.1.2 培养基及生化试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 哈茨木霉及转化子的培养和菌丝体的收集
• 5.2.2 哈茨木霉及转化子基因组DNA 的提取
• 5.2.3 DNA 质量的电泳检测
• 5.2.4 hph 基因的扩增反应程序和体系
• 5.2.5 TAIL-PCR 反应程序和反应体系
• 5.2.6 不同随机引物对扩增效率的影响
• 5.2.7 第一轮PCR 产物不同稀释浓度对TAIL-PCR 扩增效率的影响
• 5.2.8 第二轮产物不同稀释度对TAIL-PCR 扩增效率的影响
• 5.2.9 TAIL-PCR 产物的回收
• 5.2.10 TAIL-PCR 片段的克隆
• 5.2.11 T-DNA 侧翼序列的同源性比较
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 TAIL-PCR 体系的优化
• 5.3.2 TAIL-PCR 实验结果分析
• 5.3.3 孢子产生突变子T-DNA 侧翼序列的功能解析
• 5.4 讨论
• 5.4.1 关于TAIL-PCR
• 5.4.2 关于T-DNA 的插入位点
• 第六章 全文结论
• 6.1 全文结论及创新点
• 6.1.1 农杆菌介导的哈茨木霉转化系统的优化及T-DNA 插入突变体库的构建
• 6.1.2 哈茨木霉T-DNA 插入突变体库的评价
• 6.1.3 哈茨木霉孢子产生突变子的筛选
• 6.1.4 哈茨木霉生长及拮抗突变子的筛选
• 6.1.5 哈茨木霉T-DNA 插入侧翼序列分析
• 6.1.6 孢子产生突变子相关基因的克隆
• 6.2 有待进一步研究的问题
• 参考文献
• 附录 论文涉及的序列比对结果
• 致谢
• 作者简历