蚯蚓纤溶酶基因在番茄中的表达研究

论文摘要

蚯蚓纤溶酶（Earthworm Fibrinolytic Enzymes,简称EFE）是一组存在于蚯蚓体内的丝氨酸蛋白水解酶,具有纤维蛋白溶解活性或纤溶酶原激活活性,既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成,可以口服,目前已广泛用于临床。本研究选择具有纤溶酶最高活性的EFE7#组分编码基因为外源目的基因,进行樱桃番茄遗传转化,对其在樱桃番茄组织中的表达进行初步的研究,为进一步探索和开发含有预防和治疗血栓疾病的基因工程食品奠定基础。本研究将本实验室已构建好的含EFE基因的番茄组成型表达载体pF和番茄成熟果实特异性表达载体pEF通过三亲交配法转入根癌农杆菌EHA105中；在建立起的高效番茄农杆菌转化体系基础上,进行目的基因转入番茄植株的研究,获得了再生植株,并对其进行了分子鉴定。结果表明,质粒转化农杆菌方法—三亲交配法效率较高。确定了适合番茄组织培养的培养基配方,确定合适的农杆菌浸染浓度是OD600值为0.3,浸染时间为10min。建立起一套高效、操作性强、适合番茄的农杆菌转化体系。提取各株再生植株DNA进行目的基因的扩增,初步鉴定共得到了22株转基因植株,酪蛋白平板检测证明目的基因转入番茄植株并有一定的蚯蚓纤溶酶活性。之后进行了半定量RT-PCR分析,由于RNA质量较差,未检出EFE转录产物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 蚯蚓纤溶酶的研究进展
• 1.1.1 血栓疾病及溶栓药物的开发
• 1.1.2 蚯蚓纤溶酶
• 1.1.3 蚯蚓纤溶酶基因的表达研究
• 1.2 植物转基因技术
• 1.3 农杆菌介导的番茄遗传转化研究
• 1.3.1 番茄的基因工程研究进展
• 1.3.2 农杆菌转化机理
• 1.3.3 影响番茄转化的因素
• 1.4 转基因植物的检测技术
• 1.4.1 转基因植物的检测方法
• 1.4.2 蚯蚓纤溶酶活性的检测方法
• 1.4.3 转基因沉默
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 PCR引物设计
• 2.1.3 菌株及载体
• 2.1.4 试剂、溶液和培养基配方
• 2.2 重组质粒PF和PEF的鉴定
• 2.2.1 碱裂解法中量提取制备质粒DNA
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.3 质粒DNA转化大肠杆菌
• 2.2.4 EFE和E8基因的PCR扩增
• 2.2.5 质粒酶切鉴定体系
• 2.2.6 三亲交配法将中间载体导入农杆菌
• 2.3 农杆菌介导的番茄的遗传转化
• 2.3.1 番茄无菌苗和再生苗的获得
• 2.3.2 抗生素敏感浓度的选择
• 2.3.3 目的基因转化
• 2.3.4 试管苗的移栽和培养
• 2.4 转基因苗的检测和鉴定
• 2.4.1 基因组水平初步检测转基因苗
• 2.4.2 酪蛋白平板法检测转基因苗的EFE活性
• 2.4.3 转基因苗转录水平的检测
• 第3章 结果与分析
• 3.1 目的基因转化结果
• 3.1.1 质粒pF和pEF的鉴定结果
• 3.1.2 三亲交配法将目的基因导入农杆菌
• 3.1.3 农杆菌质粒重导入大肠杆菌并鉴定
• 3.2 转基因番茄的组织培养
• 3.2.1 抗性敏感性试验结果
• 3.2.2 转化愈伤组织不定芽与根的生长
• 3.2.3 再生番茄幼苗移栽出来的生长
• 3.2.4 再生番茄苗开花期和坐果期的生长
• 3.3 转化的番茄植株的检测与鉴定
• 3.3.1 转基因番茄的初步检测
• 3.3.2 酪蛋白平板法检测结果
• 3.3.3 半定量RT-PCR检测结果
• 第4章 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 使用抗生素浓度确定
• 4.1.2 番茄总RNA提取
• 4.1.3 表达产物的活性
• 4.1.4 pF载体和pEF载体对结果产生的不同影响
• 4.2 结论
• 4.2.1 建立起一套番茄组织培养和目的基因转化的体系
• 4.2.2 得到阳性转基因植株,初步检测表明部分植株果实表现出一定的EFE活性
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢