导读:本文包含了苏云金素论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:苏云金素,非核糖体肽合成酶,基因敲除,温敏型质粒
苏云金素论文文献综述
罗春平,李俊花,徐子雅,彭东海,阮丽芳[1]（2014）在《苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶基因thu2功能的初步分析》一文中研究指出对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒pHT304-TS构建基因thu2的插入缺失质粒pEMB1434,电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43后,通过抗性筛选和PCR验证得到thu2基因同源双交换基因敲除突变株CT-43-22。HPLC(高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography)检测发现CT-43-22没有苏云金素特征吸收峰;用pHT304构建得到含有完整thu2基因的回补质粒pEMB1435,电转化CT-43-22后得到互补重组菌CT-43-22b,发现其恢复了苏云金素的产生。显微镜观察突变株和互补重组菌均能产生正常的晶体和芽胞。thu2的基因敲除和基因互补实验证明,thu2基因为CT-43苏云金素生物合成的必需基因,但对晶体和芽胞的形成没有影响。(本文来源于《氨基酸和生物资源》期刊2014年01期）
李俊花[2]（2013）在《苏云金芽胞杆菌CT43中thu1和thuT是苏云金素合成与分泌的关键基因》一文中研究指出苏云金芽胞杆菌是一种广泛分布于世界各地并能形成芽胞的革兰氏阳性细菌,它在胞内和胞外均可产生多种活性物质,苏云金素就是在稳定期的胞外产生的一种热稳定的腺苷类小分子活性物质,它对多种昆虫、螨虫和线虫均有毒杀活性。苏云金素这一小分子的结构由腺苷、葡萄糖、阿洛糖二酸和磷酸基团以1：1：1：1的比例组成,分子式为C22H32O19N5P,分子量701Da。本课题组前期的工作发现了长约12Kb的苏云金素的生物合成基因簇序列,并通过生物信息学的预测推导了苏云金素的合成途径。该基因簇包含有11个基因,其中最为关键的基因有thu2(乙酰载体蛋白)、thuF(糖基转移酶)、thul(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)、thuE(丝氨酸激酶)、thuT(转运蛋白),体内敲除回补实验和体外酶催化实验已经证实基因thuE的功能是在苏云金素合成的最后一步对前体物C进行磷酸化从而形成有活力的苏云金素,而通过体内的实验也说明了thuF和thu2是苏云金素合成过程中的关键基因,因此本研究对基因thuT和thul进行了相关的研究。thuT是负责苏云金素分泌的主要基因之一且其可能利用一种特别的方式转运苏云金素。ThuT是苏云金素合成基因簇中唯一一个与转运相关的蛋白,是Major facilitater superfamily蛋白家族的成员,而这一家族的成员主要负责代谢物的转运,因此我们推测thuT与苏云金素的分泌有关。本研究利用我室构建的同框缺失系统对thuT基因进行了同框缺失,高效液相结果表明,突变株失去了产苏云金素的能力,质谱结果表明,胞外前体物C的累积量上升了76倍,因此可以说明thuT与苏云金素的产生密切相关,并且和thuE基因的功能相关。为了证实ThuT与ThuE是否共同行使功能实现苏云金素的磷酸化和转运,我们纯化得到了ThuE蛋白,拟开展ThuE和ThuT相互作用的验证。为了证实离苏云金素不远处的一个virB4-like基因virB4-2是否与苏云金素的分泌有关,是否thuT是唯一与苏云金素分泌有关的基因,我们敲除了virB4-2基因,液相结果表明该基因的缺失基本不影响苏云金素的分泌,因此我们认为thuT是负责苏云金素分泌的主要基因之一。除此之外,生物信息学分析结果表明,ThuE的亚细胞定位说明ThuE位于胞内,实验结果表明,CT43胞内却没有检测到成熟的苏云金素分子,因此我们提出了苏云金素分泌的模型。thul基因是苏云金素合成过程中的关键基因。Thul是一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶,其传统意义的功能是以L-甲硫氨酸(L-Met)和腺嘌呤核苷叁磷酸ATP为底物催化合成S-腺苷甲硫氨酸,而在本研究中,我们认为它与苏云金素分子中腺苷的组装有关,但有意思的是,它与传统意义的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的功能有区别。因此我们对该基因进行了同框缺失,液相结果表明thul基因缺失菌株失去了产苏云金素的能力,表明thul基因是苏云金素合成过程中的关键基因。为了进一步证实thul基因的功能,我们纯化得到了高浓度的Thul蛋白,准备通过体外催化并质谱检测的实验来验证thul基因的功能,这部分工作将会体现在后续做相关工作的学生的论文中。因此,本研究的重点主要有两个方面：一方面是通过thuT基因的同框缺失和敲除后出现的累积物质的检测实验证明thuT是负责苏云金素分泌的主要基因之一,并且其功能的发挥可能会和thuE基因的功能相关,于是我们推测了苏云金素分泌的途径。而CT43胞内代谢物检测发现没有成熟的苏云金素分子,也初步证实了我们的假设。另外通过thul基因的同框缺失证实,thul是苏云金素合成的必需基因,已纯化得到高纯度的Thul蛋白,其体外功能有待今后工作的证实。(本文来源于《华中农业大学》期刊2013-06-01）
罗春平[3]（2011）在《苏云金素生物合成基因簇中thu2和thuF基因功能研究》一文中研究指出苏云金芽胞杆菌是一类广泛存在于自然界中的能形成芽胞的革兰氏阳性细菌,它能够产生多种生物活性物质对多个种类的昆虫有毒杀作用。苏云金芽胞杆菌已广泛应用于生物农药的开发和转农作物基因来源。苏云金素是由某些苏云金芽胞杆菌产生的对多种昆虫具有杀虫活性的小分子量核苷类活性物质,具有较好的热稳定性,对多个目的无脊椎动物昆虫,以及数种螨类和线虫均有毒性。苏云金素的化学式为C22H32O19N5P,分子量为701 Da,由腺苷,葡萄糖,阿洛糖二酸和磷酸基团组成。本实验室研究小组已经分析预测了高产苏云金素的苏云金芽胞杆菌CT-43菌株中的苏云金素生物合成基因簇中各个基因的功能,并推导了苏云金素的生物合成途径。通过对基因簇中thuE基因的敲除和回补实验,证实了thuE基因与苏云金素的产生密切相关。克隆和表达thuE基因,得到蛋白质ThuE,通过体外催化实验证明ThuE行使磷酸激酶的功能,在前体物C上加上磷酸基团从而合成苏云金素。本论文对苏云金素合成基因簇中的thu2和thuF基因展开了研究。通过生物信息学分析,预测thu2基因编码一种非核糖体肽合成酶,含有腺苷酰化结构域和载体蛋白结构域。推测该非核糖体肽合成酶能结合一分子阿洛糖二酸,起始苏云金素的组装合成。预测thuF基因编码一种糖基转移酶,含有糖基转移酶普遍存在的“天冬氨酸-任何氨基酸-天冬氨酸”模体。推测thuF基因的功能是在阿洛糖二酸与非核糖体肽合成酶形成复合中间体后,催化一分子葡萄糖结合到阿洛糖二酸上,完成阿洛糖二酸与葡萄糖的分子组装。木论文研究用温敏型穿梭质粒pHT304-TS分别构建了thu2基因和thuF基因的插入抗性基因敲除质粒,电转化CT-43感受态细胞后,筛选得到了thu2基因的插入缺失突变体CT-43-22,thuF基因的插入缺失突变体CT-43-F3。对两个突变体的发酵上清液进行HPLC检测,没有发现苏云金素的产生。构建thu2基因的互补质粒pEMB1435和pEMB1436,电转化CT-43-22感受态细胞得到回补重组菌CT-43-22b和CT-43-22c。HPLC结果显示,回补重组菌均能恢复苏云金素的产生。thuF基因的互补实验还有待改进。用表达6×His-tag融合蛋白的载体pET28a分别表达基因thu2和thuF,构建得到了表达载体质粒pEMB1440,pEMB1441和pEMB1442。并分别表达和纯化得到蛋白质Thu2,截短的蛋白质Thu2a和蛋白质ThuF。同时纯化得到磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp。用纯化得到的蛋白质和前体物进行体外酶催化反应。体外催化实验是根据已经推导的苏云金素生物合成途径进行的。第一步催化实验是验证Sfp能否将非核糖体肽合成酶Thu2和Thu2a转化成活化形式；第二步催化实验是在第一步的基础之上,验证活化的Thu2和Thu2a能否与前体物阿洛糖二酸发生结合反应；第叁步催化实验是在第二步的基础之上,在Thu2和Thu2a与阿洛糖二酸结合形成前体物A复合体之后,在反应体系中加入糖基转移酶ThuF和葡萄糖基供体UDP-葡萄糖(或其他活化形式的葡萄糖),验证ThuF是否能将葡萄糖基转运到前体物A复合体上形成前体物B复合体。每一步的催化实验结果还有待用质谱进行检测分析。本研究通过对苏云金芽胞杆菌CT-43中苏云金素生物合成基因簇中的thu2和thuF基因的敲除和互补实验,证明了thu2和thuF基因在苏云金素的生物合成中有决定性作用。本研究还通过生物信息学方法分析和预测了thu2和thuF基因的功能,克隆并表达得到了蛋白质Thu2,Thu2a和ThuF,并建立了体外催化实验反应的体系,为下一步的研究工作奠定了坚实的实验基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2011-06-01）
陈慧杰[4]（2010）在《苏云金芽胞杆菌CT-43菌株中virD4和virB11基因在苏云金素合成中的功能研究》一文中研究指出苏云金素(Thuringiensin, Thu)是由一些苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的一种具有杀虫活性的小分子腺苷类化合物。本研究小组前期在Thu高产菌株CT-43中克隆到了Thu的合成基因簇,并推导和验证了其合成途径。Ⅳ型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中,也发现存在于少数革兰氏阳性细菌、无细胞壁细菌和古菌中。该分泌系统能够分泌如单聚体蛋白质、蛋白质-DNA和多亚基毒素等物质,但是目前为止还未有关于Ⅳ型分泌系统分泌小分子物质的报道。序列分析发现在CT-43中Thu合成基因簇附近含有virB4、virBll及virD4等类Ⅳ型分泌系统(Type IV secretion systems, T4SSs)相关基因,推测其可能与Thu的分泌相关。本研究拟通过基因敲除的方法,验证类Ⅳ型分泌系统相关基因(virBll和virD4)对Thu合成和分泌的影响。利用插入缺失突变的方法,构建同源双交换载体,首先敲除了CT-43中的virD4基因,得到的突变株BMB1122。HPLC检测BMB1122和CT-43胞外发酵上清液和胞内代谢物,结果显示突变株BMB1122发酵上清液和细胞内都未检测到Thu特征吸收峰,说明virD4基因中断影响了Thu的合成。进一步通过LCMS-IT-TOF飞行质谱检测突变株BMB1122的胞内代谢物,发现其细胞内含有与预测的Thu合成途径中所有中间产物相符的质荷比(m／z),只是没有检测到与Thu相符的质荷比。这些结果说明virD4基因的中断使Thu的合成停留在了最后加磷酸的那一步。此外,推导的Thu合成途径中最后一步是在跨膜的过程中添加一个分子的磷酸。因此,有可能是virD4基因的敲除破坏了类Ⅳ型分泌系统,使Thu合成过程的最后一个中间产物不能跨膜分泌。本研究同时也开展了virBll基因敲除和功能验证的工作,目前已经成功构建了用于同源双交换的基因敲除载体,virBll基因中断对Thu合成与分泌功能验证的后续工作还在进行中。本研究证明了virD4基因与Thu的合成相关,virD4基因的敲除使Thu的合成停留在了跨膜分泌的前一步。本研究的发现加深了我们对Thu合成与分泌过程的认识。本研究同时也证明了苏云金芽胞杆菌的类Ⅳ型分泌系统能分泌类似Thu的小分子物质,为革兰氏阳性细菌中类Ⅳ型系分泌系统的研究提供了新的信息。(本文来源于《华中农业大学》期刊2010-06-01）
胡振飞[5]（2010）在《苏云金芽胞杆菌菌株CT-43中苏云金素合成基因簇中thuE基因的功能鉴定》一文中研究指出苏云金素(Thuringiensin,简称Thu)是由某些苏云金芽胞杆菌产生的,具有杀虫活性的小分子核苷类似物。本实验室前期研究通过构建苏云金芽胞杆菌CT-43的总DNA的BAC文库,经过HPLC筛选得到苏云金素的合成基因簇,并对此基因簇进行序列分析。BLAST分析显示,基因thuE的序列和丝氨酸激酶具有较高相似性,推测基因thuE与苏云金素合成途径中的磷酸化有关。在此基础上,对菌株CT-43中的基因thuE进行同源双交换敲除,敲除得到的突变株CT-43-A3不产苏云金素。初步证明基因thuE和菌株CT-43中的苏云金素合成相关。本研究在此基础上,对突变株CT-43-A3中基因thuE的功能进行互补,对基因thuE的体外催化功能进行鉴定。本研究对突变株CT-43-A3中敲除的thuE基因进行功能互补,利用载体pHT304将含有启动子的基因thuE转入突变株CT-43-A3中,得到重组菌株。对得到的重组菌株发酵上清液进行HPLC分析,HPLC结果显示,重组菌株可以恢复Thu的产生。证明基因thuE和Thu的合成相关。本研究利用PCR技术扩增得到菌株CT-43中的基因thuE的完整ORF,扩增到的基因thuE定向克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1中。得到的重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3), IPTG诱导表达,诱导后的菌株利用可以纯化含有GST标签的试剂盒对重组蛋白进行纯化,得到基因thuE的表达产物蛋白ThuE。利用CIAP处理Thu,高效液相色谱和质谱联用检测处理后的物质的分子量为620.1593。处理后的物质在一级质谱的基础上进行二级质谱分析,二级质谱解析分子量为620.1593的物质,并结合推测的苏云金素合成途径,证明CIAP处理Thu得到的分子量为620.1593的物质为不含磷酸基团的前体物。其特征与推测的蛋白ThuE的底物前体物C相同。将蛋白ThuE和前提物C在缓冲体系中进行体外催化处理,高效液相色谱和质谱对催化结果进行分析。结果显示体外催化后的体系中含有Thu。证明蛋白ThuE可以在体外催化体系中和前体物C反应生成Thu。别粘酸是Thu的分子组成成分之一。本研究利用蛋白ThuE对别粘酸进行体外催化分析,对蛋白ThuE的底物特异性进行检测。催化反应体系经过高效液相色谱检测显示,催化后物质的保留时间和别粘酸不同,质谱分析得到新的分子量,说明蛋白ThuE可以在体外催化别粘酸形成新的物质。本研究证明,基因thuE和Thu的合成相关。其功能为,在Thu合成过程中行使磷酸激酶的功能,在前体物C上加上磷酸基团从而合成Thu。此功能符合推测得到的苏云金素合成途径中基因thuE的功能。本研究对基因thuE的功能分析验证了基因thuE在Thu合成途径中的功能,为Thu合成途径的进一步验证打下了良好的基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2010-06-01）
刘要,阮丽芳,刘晓艳,曹诗云,孙明[6]（2010）在《提高苏云金素合成纯度的发酵工艺的优化》一文中研究指出苏云金芽胞杆菌中华亚种CT-43菌株(Bacillus thuringien sissubsp.chinensis)是高产苏云金素(简称Thu)的野生菌株。但在产生Thu时总伴随有其他代谢物(简称ZZ)的合成。而且ZZ很难与Thu分离开。本实验通过比较不同的培养基,得到G培养基能抑制菌株CT-43合成ZZ。然后利用分批补料发酵的方法,通过正交试验设计,进一步抑制ZZ的合成,并提高Thu在有机萃取物中的含量。得到优化后的发酵工艺是:菌株CT-43在G培养基中培养至第20h,同时补柠檬酸钠和葡萄糖至终浓度分别为2.0g/L和16g/L,再继续发酵至第52h。通过此发酵工艺制备的Thu峰面积占初提物总峰面积的74.84%,比用LB培养基发酵所得提取物的29.85%提高了两倍多。为得到高纯度的Thu和更深入的研究创造了条件。最后通过液质联用技术证实,发酵工艺优化后,菌株CT-43发酵上清液中主要物质是Thu,几乎检测不到ZZ,而且优化后的Thu分子量并没有改变。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2010年02期）
刘要[7]（2009）在《苏云金杆菌芽胞中华亚种中一种具有杀线虫活性新毒素的初步鉴定及其与苏云金素的代谢关系》一文中研究指出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种在土壤中广泛分布的革兰氏阳性细菌。在其生长的过程中,会向胞外分泌一些小分子代谢物。如苏云金素(thuringienisn,简称Thu)和双效菌素(Zwittermicin A,简称ZwA)等。它们对许多农业害虫都具有毒杀活性,有着广阔的应用前景。苏云金芽胞杆菌中华亚种(B.thuringiensis subsp.chinensis)CT-43菌株是本室分离得到的一株高产苏云金素的野生菌株。本研究将CT-43在LB培养基中培养至指数期末期,采用有机溶剂萃取法提取上清液中的苏云金素。HPLC(Higher pressure liquidchromatogram)检测结果显示上清萃取液含两个主峰。经HPLC-MS(HPLC-Massspectrometry)进一步分析鉴定,保留时间为7 min的峰为苏云金素特征吸收峰,保留时间为6 min左右的峰为未知代谢物吸收峰,本研究将其命名为Tox-x。通过液质联用分析,得出其分子量是677。通过与目前己报道的苏云金杆菌所产代谢物进行比较,确定Tox-x为一新型代谢物。本研究进一步以秀丽小杆线虫为目标害虫对其进行活性检测,发现Tox-x对秀丽小杆线虫具有毒杀活性,原液稀释6.25倍的线虫致死率达到90%。本研究进一步通过确立培养基配方,补料成分及补料时间,分别得到产高纯度苏云金素的发酵工艺和产高纯度Tox-x的培养基。研究结果如下:将CT-43菌株在G培养基中培养至第20 h,同时补柠檬酸钠和葡萄糖至终浓度分别为2.0g L~(-1)和16 gL~(-1),再继续发酵32 h,然后采用有机溶剂萃取法提取上清液中的苏云金素。HPLC检测结果显示,此发酵工艺制备的苏云金素峰面积占初提物总峰面积的74.84%,比用LB培养基发酵所得提取物中苏云金素占总峰面积的29.85%提高了一倍多。通过改变LB培养基中各营养物质的浓度,得到产高纯度的Tox-x的LB-1培养基。其配方是:酵母提取物浓度为18 g L~(-1),胰蛋白胨浓度为15 g L~(-1),氯化钠浓度为10 g L~(-1)。将CT-43在LB-1培养基中发酵32 h,然后将发酵上清萃取液进行HPLC分析,结果显示LB-1培养基发酵所得提取物中Tox-x峰面积占初提物总峰面积66.59%,比用LB培养基发酵所得提取物中Tox-x占总峰面积的31.76%提高了两倍多。本研究同时将本室保存的6株CT-43质粒消除突变株进行了产苏云金素或Tox-x的HPLC检测,研究发现CT-43-7只能产生高纯度的苏云金素,不产Tox-x;而突变株CT-43-55只产Tox-x,而不产苏云金素。所以可以用相应的突变株来提纯苏云金素和Tox-x。(本文来源于《华中农业大学》期刊2009-06-01）
刘晓艳[8]（2008）在《苏云金芽胞杆菌菌株CT-43中苏云金素合成基因簇thuABCDEFG的克隆与合成途径分析》一文中研究指出苏云金素(thuringiensin),本文将其简称为Thu,是由某些苏云金芽胞杆菌产生的小分子量核苷类杀虫活性物质,化学式C_(22)H_(32)O_(19)N_5P。对直翅目、等翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和双翅目等6种昆虫、数种螨类和线虫具有毒杀作用。目前国内外研究居多的是苏云金素的分离与纯化方面,对于其分子水平的研究则较少,关于苏云金素是如何合成或调控的等方面依然是未知。本研究以苏云金素高产菌株苏云金芽胞杆菌CT-43为出发菌株,通过质粒消除和Southern杂交实验初步将苏云金素合成相关基因定位于一个含有cry1B基因的大质粒pBMB0558上。通过构建菌株CT-43的全基因组细菌人工染色体(BAC)文库,克隆并测序了质粒pBMB0558。该质粒全长109,464 bp,序列分析发现pBMB0558含有一个与抗生素合成类似的NRPS＼PKS基因簇,该基因簇依赖于一个酰基载体蛋白(ACP)并具有部分非核糖体肽合成酶基因。在此基因簇旁边还有一个类Ⅳ型分泌途径,含有VirB4,VirB11及VirD4等蛋白编码基因。此外pBMB0558上还含有一个原噬菌体(prophage)和一些与结合转移及转座相关的基因。通过构建一个可以装载大片段的穿梭载体pEMB0557,菌株CT-43的全基因组苏云金芽胞杆菌BAC文库构建完成并进行了苏云金素表达子的筛选。高效液相色谱(HPLC)筛选出一个可以异源产生苏云金素的BAC克隆子,对此BAC克隆子进行功能域的缩小实验,将苏云金素合成基因簇定位在12 kb片段上,并命名此簇为thuABCDEFG,序列分析显示该片段来自于质粒pBMB0558。对thuABCDEFG进行进一步的生物信息学分析,推导出了苏云金素的合成途径,共分为两个部分:阿洛糖二酸(allose diacid)的合成与苏云金素前体物腺苷葡萄糖阿洛糖二酸(adenosine glucose allose diacid)的组装。阿洛糖二酸的合成前体物可能来源于常规代谢途径中的6-磷酸葡萄糖,而组装过程类似于非核糖体肽/聚酮合成途径的杂合途径,但与已经报道的杂合途径又有差别。该途径可以分为叁个功能模块,模块一负责阿洛糖二酸的识别与悬挂;模块二负责糖苷的转移;模块叁进行腺苷的识别与连接。其中模块一又可以分为叁个功能区域,区域一是酰基载体蛋白来自于聚酮合成途径(PKS),但另外两个区域腺苷酰化区域(A)和缩合区域(C)则来自于非核糖体肽途径(NRPS),所以命名为NRPS/PKS-like途径。基因簇旁边的甲基转移酶(methyltransferase)推测与合成后修饰相关。为了验证此途径,本研究还开展了基因簇thuABCDEFG中的一个在3′-C原子上添加磷酸基团的特殊酶基因thuE的基因中断实验。中断后的突变株BMB0545和野生株CT-43的上清液和胞内代谢物分别进行了LC-micrOTOF和LCMS-IT-TOF飞行质谱实验,质谱结果显示thuE基因中断后,上清液中没有了苏云金素的700的m/z值,胞内代谢物的m/z值证明了6-磷酸葡萄糖(6-P-glucose,m/z:259)、6-磷酸葡萄糖酸(6-P-glucoseacid,m/z:275)、阿洛糖酸(allose acid,m/z:195)、阿洛糖二酸(allose diacid,m/z:209)、腺苷(adenosine,m/z:266)、葡萄糖阿洛糖二酸(m/z:354)、腺苷葡萄糖阿洛糖二酸(adenosine glucose allose diacid,m/z:603)等前体物的存在,而且在突变株BMB0545胞内m/z值为603的腺苷葡萄糖阿洛糖二酸发生了积累,部分验证了该途径的可行性。在野生株CT-43的胞内没有m/z值为700的苏云金素的存在,证明磷酸基团是在合成途径中最后一步加到前体物腺苷葡萄糖阿洛糖二酸上,且可能是在跨膜的过程中添加,保证了细胞内不存在完整的苏云金素分子,从而可以保护细胞不会受到苏云金素的毒害。(本文来源于《华中农业大学》期刊2008-12-01）
郭承亮,胡振飞,刘晓艳,余子全,阮丽芳[9]（2008）在《苏云金芽胞杆菌产苏云金素菌株CT-43及其缺失突变株的差异蛋白》一文中研究指出【目的】苏云金素(Thuringiensin)的合成和代谢途径的相关研究在国内外一直进展缓慢,本文拟从蛋白质组水平揭示与苏云金素合成或代谢相关的蛋白。【方法】利用双向电泳技术研究了高产苏云金素的苏云金芽胞杆菌野生菌株CT-43、其高产突变菌株CT-43-1C及不产突变菌株BMB0806在蛋白表达水平的差异,然后对差异蛋白点进行质谱鉴定,最后对鉴定出的蛋白进行生物信息学分析。【结果】与野生型和高产菌株相比,在BMB0806中发现了13个差异显着的蛋白点,鉴定出了其中的9个,生物信息学结果显示有6个蛋白可能与苏云金素合成或代谢相关。【结论】通过蛋白质组研究找到了6个可能与苏云金素合成或代谢相关的蛋白,为苏云金素合成基因簇的克隆和合成途径的验证提供了有力的证据。(本文来源于《微生物学报》期刊2008年07期）
郭承亮[10]（2008）在《苏云金芽胞杆菌菌株CT-43产苏云金素及其缺失突变株的差异蛋白》一文中研究指出苏云金素(thuringiensin)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)某些菌株产生的一种热稳定的外毒素,它是一种核苷类似物,分子量701,它的作用机制是通过和ATP竞争酶的结合位点,从而抑制DNA依赖性RNA聚合酶的活性,所以具有广谱的杀虫活性。并且,苏云金素的毒性远低于大多数化学农药,所以它具有广谱杀虫剂的开发潜力。为了研究苏云金芽胞杆菌中苏云金素合成基因簇的代谢途径,利用双向电泳技术研究了苏云金芽胞杆菌高产苏云金素的野生菌株CT-43、其高产突变菌株CT-43-1C及不产突变菌株F-15在蛋白表达水平上的差异,通过软件分析并对差异蛋白点进行质谱鉴定,最后对鉴定出的蛋白进行生物信息学分析。与野生型菌株和高产菌株相比,在F-15中发现了13个差异显着的蛋白点,鉴定出了其中的9个,生物信息学结果显示有6个蛋白可能与苏云金素合成或代谢相关。其中,F-15菌株相对于高产菌株而言,二羟基丙酮激酶和N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的缺失以及乌头酸水合酶1表达量的提高可能与苏云金素的代谢调控相关;UvrB/UvrCprotein表达量的降低可能与苏云金素的分泌途径相关;另外还发现phoH protein的缺失,可能与苏云金素合成途径中含磷的代谢中间物以及代谢能量相关;而亮氨酸-tRNA合成酶的含量的降低,导致突变菌株的生理代谢水平降低,从而可能影响到苏云金素的合成。本文通过蛋白质组研究找到了6个可能与苏云金素合成或代谢相关的蛋白,为苏云金素合成基因簇的克隆和合成途径的验证提供了有力的证据。(本文来源于《华中农业大学》期刊2008-06-01）
苏云金素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
苏云金芽胞杆菌是一种广泛分布于世界各地并能形成芽胞的革兰氏阳性细菌,它在胞内和胞外均可产生多种活性物质,苏云金素就是在稳定期的胞外产生的一种热稳定的腺苷类小分子活性物质,它对多种昆虫、螨虫和线虫均有毒杀活性。苏云金素这一小分子的结构由腺苷、葡萄糖、阿洛糖二酸和磷酸基团以1：1：1：1的比例组成,分子式为C22H32O19N5P,分子量701Da。本课题组前期的工作发现了长约12Kb的苏云金素的生物合成基因簇序列,并通过生物信息学的预测推导了苏云金素的合成途径。该基因簇包含有11个基因,其中最为关键的基因有thu2(乙酰载体蛋白)、thuF(糖基转移酶)、thul(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)、thuE(丝氨酸激酶)、thuT(转运蛋白),体内敲除回补实验和体外酶催化实验已经证实基因thuE的功能是在苏云金素合成的最后一步对前体物C进行磷酸化从而形成有活力的苏云金素,而通过体内的实验也说明了thuF和thu2是苏云金素合成过程中的关键基因,因此本研究对基因thuT和thul进行了相关的研究。thuT是负责苏云金素分泌的主要基因之一且其可能利用一种特别的方式转运苏云金素。ThuT是苏云金素合成基因簇中唯一一个与转运相关的蛋白,是Major facilitater superfamily蛋白家族的成员,而这一家族的成员主要负责代谢物的转运,因此我们推测thuT与苏云金素的分泌有关。本研究利用我室构建的同框缺失系统对thuT基因进行了同框缺失,高效液相结果表明,突变株失去了产苏云金素的能力,质谱结果表明,胞外前体物C的累积量上升了76倍,因此可以说明thuT与苏云金素的产生密切相关,并且和thuE基因的功能相关。为了证实ThuT与ThuE是否共同行使功能实现苏云金素的磷酸化和转运,我们纯化得到了ThuE蛋白,拟开展ThuE和ThuT相互作用的验证。为了证实离苏云金素不远处的一个virB4-like基因virB4-2是否与苏云金素的分泌有关,是否thuT是唯一与苏云金素分泌有关的基因,我们敲除了virB4-2基因,液相结果表明该基因的缺失基本不影响苏云金素的分泌,因此我们认为thuT是负责苏云金素分泌的主要基因之一。除此之外,生物信息学分析结果表明,ThuE的亚细胞定位说明ThuE位于胞内,实验结果表明,CT43胞内却没有检测到成熟的苏云金素分子,因此我们提出了苏云金素分泌的模型。thul基因是苏云金素合成过程中的关键基因。Thul是一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶,其传统意义的功能是以L-甲硫氨酸(L-Met)和腺嘌呤核苷叁磷酸ATP为底物催化合成S-腺苷甲硫氨酸,而在本研究中,我们认为它与苏云金素分子中腺苷的组装有关,但有意思的是,它与传统意义的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的功能有区别。因此我们对该基因进行了同框缺失,液相结果表明thul基因缺失菌株失去了产苏云金素的能力,表明thul基因是苏云金素合成过程中的关键基因。为了进一步证实thul基因的功能,我们纯化得到了高浓度的Thul蛋白,准备通过体外催化并质谱检测的实验来验证thul基因的功能,这部分工作将会体现在后续做相关工作的学生的论文中。因此,本研究的重点主要有两个方面：一方面是通过thuT基因的同框缺失和敲除后出现的累积物质的检测实验证明thuT是负责苏云金素分泌的主要基因之一,并且其功能的发挥可能会和thuE基因的功能相关,于是我们推测了苏云金素分泌的途径。而CT43胞内代谢物检测发现没有成熟的苏云金素分子,也初步证实了我们的假设。另外通过thul基因的同框缺失证实,thul是苏云金素合成的必需基因,已纯化得到高纯度的Thul蛋白,其体外功能有待今后工作的证实。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
苏云金素论文参考文献
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