马病毒性动脉炎新型快速分子检测技术研究与应用

论文摘要

马动脉炎病毒（EAV）是马病毒性动脉炎（EVA）的病原，EVA是各国马匹进出口检疫中必检的二类检疫性传染病。本研究在RK-13细胞上培养的马动脉炎病毒在4℃、室温和37℃条件下，用各种动物的红细胞进行血凝试验，证实病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞，但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅红细胞。病毒用吐温-80和乙醚处理后，血凝活力会显著增强，其血凝滴度比未经处理的病毒高4～8倍，且血凝像更加清晰。最适处理条件是病毒在冰浴状态下用终浓度0.06～0.125％（V／V）吐温-80振荡处理15～60 min，再加50％（V／V）乙醚振荡作用5～15min。用EAV免疫SPF豚鼠，4周后采血做HI和NT试验，显示HI抗体和NT抗体产物成正相关。对550份来自新西兰、吉尔吉斯、内蒙古、新疆的马血清做EAV的抗体检测。比较两个试验，二者符合率为97.8％，，血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关，抗体效价也略低于后者。 参照美国的马病毒性动脉炎（EVA）诊断技术，确立了EAV在RK-13细胞上生长的最适条件，制备了EAV标准株Bucyrus高免血清，在此基础上应用马动脉炎病毒（EAV）标准种毒和EAV标准阳性、标准阴性血清，建立了检测EAV抗体的微量血清中和试验。用标准马传贫阳性血清进行交叉中和试验未发现交叉反应。应用建立的中和试验方法对进出口的9121头份马血清抗体检测，有305头血清抗体滴度达1：4～1：128。用自制的琼扩抗原进行比较试验，只检出68头份血清样品为EAV抗体阳性，微量中和试验比琼扩试验敏感性高。 选取EAV病毒基因组中高度保守的开放阅读框7（ORF7）序列，设计了特异性引物和Taqman探针，利用一步法的实时定量RT-PCR来定量检测EAV。使用含有选定检测序列的克隆标准品做标准曲线，证明该方法可从组织培养液（TCF）中检出含有5PFU／100μL病毒拷贝。对马疱疹病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等无交叉反应，特异性好。用疫苗用种毒（Bucyrus标准株）肌肉注射小马后，定量RT-PCR比病毒分离试验更能灵敏地检出呼吸道排出的病毒。经对456份临床鼻腔分泌物样品检测结果，定量RT-PCR检出6份阳性，而病毒分离只检出2份阳性。一步法实时定量RT-PCR检测样品中的马病毒性动脉炎病毒，在快捷、准确、方便和高通量方面优于传统的ELISA和细胞培养病毒分离的检测方法，因此可以作为检测马病毒性动脉炎（EVA）病毒有效的快速方法。 在分析马动脉炎病毒GL蛋白抗原性的基础上，设计一对引物克隆GL蛋白一段

论文目录

• 原创性声明
• 学位论文版权使用授权书
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 马病毒性动脉炎研究进展
• 第二章 马病毒性动脉炎疫苗与检测技术研究进展
• 第二部分 研究内容
• 第三章 马病毒性动脉炎血凝与血凝抑制试验研究与应用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第四章 马病毒性动脉炎微量血清中和实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第五章 实时定量RT-PCR检测马动脉炎病毒的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第六章 马动脉炎病毒GL蛋白主要抗原域的表达及间接ELISA的初步建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 全文总结
• 攻读学位期间发表的文章
• 致谢
• 附录