枳CBF1类似基因PtCBF1启动子的克隆与功能分析

论文摘要

柑橘是世界第一大果树。它极易受到低温伤害。因此培育抗寒品种一直是柑橘育种研究者的一个重要的目标。适度的提高柑橘栽培品种的抗冻性,就可以为栽培者节省数百万美元的损失。然而柑橘属植物存在雌雄性败育、珠心胚干扰、遗传高度杂合、童期长等现象,阻碍了传统育种的发展,而不断发展的基因工程,为柑橘抗寒育种提供了一条新的途径。虽然人们已经对柑橘的抗寒基因工程进行了一些尝试,但是效果并不是很理想。主要原因是对植物,尤其是柑橘抗冻机理还不是很了解,同时早期基因工程中常用组成性启动子驱使单个外源基因表达,也影响了有效转基因品种的获得。因此,获得适合柑橘中应答低温的启动子及深刻了解柑橘抗寒的机理,是柑橘抗寒基因工程成功的保证。本文旨在分离出耐寒的柑橘近缘植物枳中冷应答基因PtCBF1的启动子,研究其在转基因枳中的活性特点,评价其在柑橘及植物基因工程中潜在应用价值。在此基础上,对启动子上特异的顺式作用元件进行研究,找出决定启动子活性的最重要的功能区域,进一步揭示柑橘类植物抗低温的机制。主要研究结果如下:1.根据PtCBF1 cDNA序列,设计引物分离出PtCBF1编码区的DNA序列,发现该基因不含内含子,与其它植物中同源基因一致,保留了这个不符合一般真核生物基因的特征。2.通过TAIL-PCR及SON-PCR进行两轮染色体步行,得到1115bp的上游序列,设计引物进行PCR验证,发现该序列确实为PtCBF1的上游序列。3.对PtCBF1的上游序列进行生物信息学分析发现它具有成为启动子所必需的各种元件,同时还发现启动子上具有多种可能应答环境胁迫的元件,在正负链共发现7份ABRE,3份HSE,7份MYB位点,16份MYC位点,8份G-box,5份Ca2+应答元件,2份生长素应答元件,5份GA诱导的元件,以及多份光诱导及组织特异表达的元件等。另外,MEME预测还发现了三种统计学显著的模体。4.将该启动子连接报告基因,通过基因枪介导转化洋葱表皮细胞及农杆菌介导转化枳上胚轴,荧光检测表明该启动子在冷诱导下有活性,但是确定它的低温活性特点还需要进一步实验验证。5.为了进一步了解低温下柑橘中的基因调控机理,我们对启动子序列进行部分缺失及功能获得试验。结果发现该启动子上距转录起始位点-555至-355之间的序列对启动子的功能有很大的影响。这段序列中的三个MYC识别位点可能对其功能有很大的作用。在枳中极有可能存在ICE1类似的bHLH蛋白通过冷诱导激活后结合在该顺式元件上,以诱导启动子的活性,促使下游基因表达。因此,推测柑橘类植物存在类似拟南芥中冷应答的ICE1-CBF调控途径,但同时又存在种属特异的低温应答调控方式。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1 柑橘抗寒研究的意义
• 2 柑橘抗寒研究的现状
• 2.1 细胞膜与柑橘抗寒
• 2.2 细胞抗氧化途径与柑橘抗寒
• 2.3 细胞的渗透调节物与柑橘抗寒
• 2.4 植物生长物质与柑橘抗寒
• 2.5 植物细胞应答低温的基因与柑橘抗寒
• 3 冷胁迫应答基因的调节网络
• 3.1 依赖ABA的低温应答途径
• 3.1.1 AREB/ABF-ABRE途径
• 3.1.2 其他类型的ABA依赖的基因表达途径
• 3.2 非ABA依赖的低温应答途径
• 3.2.1 CBF途径
• 3.2.2 ICE1途径
• 3.2.3 其他调节CBF表达的途径
• 3.2.4 参与冷驯化的非CBF冷调节途径
• 3.2.5 春化作用途径
• 4 果树抗逆性基因工程研究进展
• 5 植物启动子研究
• 5.1 植物启动子的基本结构及功能
• 5.2 启动子的类型
• 5.2.1 组成型启动子
• 5.2.2 组织特异型启动子
• 5.2.3 诱导型启动子
• 6 本研究的目的意义
• 第二章 PtCBF1上游序列的分离
• 1 前言
• 2 材料与试剂
• 2.1 材料
• 2.2 实验试剂
• 3 实验方法
• 3.1 基因组DNA的提取及检测
• 3.1.1 基因组DNA的提取
• 3.1.2 基因组DNA的检测
• 3.2 PtCBF1编码区DNA区PCR扩增
• 3.3 PCR产物的检测及回收
• 3.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.3.2 回收纯化目标片断
• 3.4 目的片段与载体的连接
• 3.5 大肠杆菌的转化及阳性克隆的增殖
• 2法制备感受态细胞'>3.5.1 CaCl₂法制备感受态细胞
• 3.5.2 转化
• 3.5.3 阳性克隆的增值
• 3.6 检测阳性克隆
• 3.6.1 质粒DNA的提取（碱裂解法）
• 3.6.2 阳性检测
• 3.7 TAIL-PCR扩增启动子序列
• 3.8 SON-PCR克隆PtCBF1启动子序列
• 3.9 PCR验证所克隆的启动子序列
• 3.10 生物信息学分析
• 4 结果与分析
• 4.1 PtCBF1编码区DNA克隆
• 4.2 TAIL-PCR扩增启动子序列
• 4.3 利用SON-PCR进行第二轮染色体步行
• 4.4 PCR验证所克隆的启动子序列
• 4.5 生物信息学分析所克隆的启动子序列
• 4.5.1 比对与TSS预测
• 4.5.2 顺式元件预测
• 5 讨论
• 第三章 PtCBF1启动子功能的验证及分析
• 1 前言
• 2 材料与试剂
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 3 实验方法
• 3.1 表达载体构建
• 3.1.1 引物设计及PCR
• 3.1.2 TA克隆及正反向插入的检测
• 3.1.3 酶切、连接
• 3.1.4 大肠杆菌的转化
• 3.1.5 构建载体的检测
• 3.2 基因枪介导法转化洋葱表皮
• 3.2.1 洋葱表皮细胞的培养
• 3.2.2 金粉准备
• 3.2.3 微弹制备
• 3.2.4 基因枪的准备
• 3.2.5 基因枪的轰击
• 3.2.6 洋葱表皮培养及观察
• 3.3 根癌农杆菌感受态细胞制备
• 3.4 工程菌的制备
• 3.4.1 转化农杆菌
• 3.4.2 菌落阳性检测及工程菌保存
• 3.5 Floral Dip法转化拟南芥
• 3.5.1 植物材料准备
• 3.5.2 农杆菌准备
• 3.5.3 拟南芥的转化
• 3.5.4 转化植株的筛选
• 3.6 农杆菌介导法转化枳上胚轴
• 3.6.1 枳无菌繁殖
• 3.6.2 外植体预培养
• 3.6.3 农杆菌培养
• 3.6.4 浸染
• 3.6.5 共培养
• 3.6.6 选择培养
• 3.6.7 继代选择培养
• 3.6.8 生根培养
• 3.6.9 嫁接培养
• 3.6.10 炼苗移栽
• 3.6.11 PCR检测及荧光检测
• 3.6.12 实验所用的组织培养基
• 4 结果与分析
• 4.1 表达载体构建
• 4.2 基因枪介导法转化洋葱表皮
• 4.3 Floral Dip法转化拟南芥
• 4.4 根癌农杆菌介导法转化枳上胚轴
• 4.4.1 枳上胚轴转基因植株的再生
• 4.4.2 转基因植株的PCR及GFP荧光检测
• 4.4.3 启动子的诱导性分析及缺失分析
• 5 讨论
• 5.1 启动子活性分析
• 5.2 启动子功能区的定位
• 5.3 转化枳上胚轴再生苗的一些问题讨论
• 5.4 使用报告基因GFP的一些讨论
• 第四章 总结与展望
• 1 本研究的成果与不足
• 2 进一步可展开的工作
• 参考文献:
• 图版和图版说明
• 致谢
• 在读期间发表的文章