从猪胚胎骨骼肌cDNA文库中分离、定位新基因并分析部分基因的功能

论文摘要

随着猪基因组研究工作的不断深入，许多与猪生产性状（生长、胴体与肉质性状）相关的新基因被证实。但相对猪整个基因组来说，仍然还有大量基因没有发现。而猪胚胎期形成的肌纤维数目与猪日增重及生长速度呈正相关，是动物产肉量的重要决定因素。因此，从猪胚胎cDNA文库中分离证实与猪生产性状相关的基因，必将会为分子育种实践提供重要的指导作用。本文从猪55天胚胎骨骼肌cDNA文库中筛选出15个功能基因，通过功能分析选出CA3和HUMMLC2B基因作进一步研究，并取得了如下结果：1．通过猪55天胚胎骨骼肌cDNA文库测序并结合猪EST数据库的信息分离出15个猪基因，即K-ALPHA-1、TUBB、MAPRE1、TUBA3、ATP6VOE、RPL6、RPL7、RPL10、HUMMLC2B、BNIP3L、NHP2L1、CA3、CCNT2、PC4和FLJ30294，并分析其cDNA及预测的蛋白质序列（CCNT2和FLJ30294除外）。2．在猪×仓鼠辐射杂种板中对上述所分离的基因进行染色体定位（HUMMLC2B除外），定位结果如下：K-ALPHA-1定位于SSC5p，TUBB定位于SSC7p11，TUBA3定位于SSC5p11-p15，MAPRE1定位于SSC17q21-23，RPL6定位于SSC14q22-24，RPL7定位于SSC4q11-14，RPL10定位于SSCXq26，ATP6VOE定位于SSC16q，BNIP3L定位于SSC14q21-22，CCNT2定位于SSC15q12-14，NHP2L1定位于SSC5p12-15，FLJ30294定位于SSC3q11-14，PC4定位于SSC16q11-14，CA3定位于SSC4q11-q14，同时用猪×啮齿类体细胞杂种板对CA3基因进行了区域定位（SSC4q11-q14）。3．对于CA3基因，通过猪cDNA文库测序和猪ESTs序列拼接分别获得了两个长短不同的cDNA序列，命为CA3b和CA3a，序列分析显示CA3b与CA3a之间存在一gap，预测的蛋白质显示CA3b缺少CA3a的C末端（78aa）。并且荧光共聚焦显微镜的观察结果显示GFP融合的CA3a蛋白位于整个细胞中，而CA3b仅位于细胞质中。4．获得了猪CA3和HUMMLC2B基因的全长基因组DNA序列，并分析了其基因组结构。结果显示CA3基因是由7个外显子和6内含子组成（相对CA3a的cDNA序列），约10.5kb。HUMMLC2B基因是由7个外显子和6个内含子组成，约2.9kb，包含多个重复序列。两个基因所有内含子和外显子的拼接位点都符合GT-AG规则。5．为了研究猪候选基因在骨骼肌发育中可能的作用，应用实时荧光定量PCR技术对候选基因进行了时空表达谱分析。结果显示，CA3基因在通城猪胚胎33天骨骼肌中表达量最低，65天达到最高，然后下降到一定程度并和出生后的表达量保持相对稳定的水平。而在大白猪胚胎骨骼肌中的表达模式和通城猪不同，即在33天表达量最低，但在65天和90天表达量没有明显差异。组织表达谱显示CA3在骨骼肌和肝脏中表达量最高，在肺脏、淋巴结、胃、大肠和小肠中表达量较低，而在心脏和脾脏中没有检测到表达。6．而HUMMLC2B基因在通城猪胚胎骨骼肌中的表达模式和长白猪相似（胚胎33天、65天、90天），但在通城猪出生后随年龄的增加其表达量不断降低（出生后2天、28天和成年）。组织表达谱分析显示HUMMLC2B基因仅在所有被检测的骨骼肌中表达，并且表达量较高，而其它组织中除脂肪中有极少量的表达外，都没有检测到表达。7．亚细胞定位结果显示GFP融合的HUMMLC2B蛋白位于整个细胞中。8．SNPs的检测结果证实CA3基因有两个可用于PCR-RFLP的SNPs位点，即BsuRI-PCR和Hinfl-PCR，分别位于第五和第六内含子中。而HUMMLC2B基因有23个潜在的SNPs，其中可用于PCR-RFLP的四个SNPs位点，即HinlI-PCR（两个），MspI-PCR和BglI-PCR，分别位于第三内含子，第四外显子和第五内含子中（MspI-PCR和BglI-PCR位点）；另外四个SNPs位点用DHPLC技术检测，两个SNPs位于第六内含子中，两个SNPs位于第七外显子中。9．对上述PCR—RFLP多态位点在五指山猪、香猪、巴马香猪三个小型猪品种以及莱芜猪、通城猪、大白猪、长白猪和杜洛克中分析基因型和等位基因频率以及各等位基因在不同猪品种中的分布差异。10．在我室与通城县畜牧局合作组建的试验群体中（三个纯繁群：通城猪、大白和长白猪及两个三元杂交群：长大通和大长通），分析猪CA3和HUMMLC2B基因的多态与部分经济性状的关联。结果显示：①对于CA3基因，G8603A位点多态与肌内脂肪含量呈极显著相关（P＜0.01），且与腿臀比率呈显著相关（P＜0.05）；G8371A位点GG基因型个体与GA基因型个体间大理石纹和肌内脂肪含量差异极显著（P＜0.01），而与三点平均背膘厚差异显著（P＜0.05）。②对于HUMMLC2B基因，G1094A和T1513C位点没有检测到与性状的关联；G1876A位点GG基因型个体和GA基因型个体间屠宰率和肉色差异显著（P＜0.05）；T2005G位点GG基因型个体与TG基因型个体肉色差异显著（P＜0.05），且TT基因型个体和TG基因型个体间红细胞数（RBC）、红细胞压积（HCT）、红细胞分布密度（RDW）差异显著（P＜0.05）。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 猪基因组的研究现状
• 1.2 cDNA文库在筛选新基因中的应用
• 1.3 CA3基因的研究进展
• 1.3.1 CA3基因的研究进展
• 1.3.1.1 CA3基因的特征
• 1.3.1.2 CA3基因的功能
• 1.3.2 CA家族其它成员的研究进展
• 1.4 HUMMLC2B基因的研究进展
• 1.5 分离的其它基因的研究进展
• 1.5.1 与微管组装有关的基因
• 1.5.2 核糖体蛋白基因
• 1.5.3 其它基因
• 1.6 实时荧光定量PCR的原理及应用
• 1.6.1 实时荧光定量PCR相关的概念
• 1.6.2 实时荧光定量PCR的原理
• 1.6.3 实时荧光定量PCR的方法
• 1.6.4 实时荧光定量PCR的应用
• 1.7 亚细胞定位在基因功能研究中的地位及定位方法
• 2 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 样品
• 3.1.1.1 DNA样品
• 3.1.1.2 组织样品
• 3.1.2 载体和菌株
• 3.1.3 试剂盒及酶
• 3.1.4 主要试剂及配制
• 3.1.4.1 主要试剂
• 3.1.4.2 试剂的配制
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.1.6 主要分子生物学软件
• 3.1.7 主要数据库
• 3.2 方法
• 3.2.1 候选基因cDNA全长序列的分离方法
• 3.2.2 候选基因基因组全长序列的分离方法
• 3.2.2.1 引物设计
• 3.2.2.2 PCR扩增的条件
• 3.2.2.3 PCR产物的纯化回收和克隆测序
• 3.2.2.4 DNA序列同源性检索鉴定
• 3.2.3 基因染色体定位的SCHP和RH法
• 3.2.3.1 基因定位的引物设计
• 3.2.3.2 PCR分型方法
• 3.2.3.3 数据分析方法
• 3.2.4 目的基因表达谱分析
• 3.2.4.1 总RNA的提取
• 3.2.4.2 cDNA的合成
• 3.2.4.3 Real-time PCR引物和TaqMan探针的设计
• 3.2.4.4 目的基因的组织表达谱分析
• 3.2.4.5 目的基因在骨骼肌发育不同时期的表达谱分析
• 3.2.4.6 表达谱的数据分析
• 3.2.5 融合蛋白的亚细胞定位
• 3.2.5.1 CA3和HUMMLC2B基因真核表达载体的构建
• 3.2.5.2 细胞培养和转染
• 3.2.5.3 细胞染色和融合蛋白的观察
• 3.2.6 猪基因的多态性检测
• 3.2.6.1 用PCR-RFLP方法检测基因多态
• 3.2.6.2 用DHPLC方法检测基因多态
• 3.2.7 猪基因与性状的关联分析
• 4 结果
• 4.1 分离基因的全长cDNA序列结果
• 4.1.1 猪CA3基因的序列分析结果
• 4.1.1.1 猪CA3基因的序列特征
• 4.1.1.2 猪CA3基因的进化树分析
• 4.1.2 猪HUMMLC2B基因的序列分析结果
• 4.1.3 分离的其它新基因的序列分析结果
• 4.2 分离基因的染色体定位
• 4.2.1 猪CA3基因的定位结果
• 4.2.2 分离的其它新基因的定位结果
• 4.3 目的基因的基因组序列分析结果
• 4.3.1 猪CA3基因的基因组DNA序列分析结果
• 4.3.2 猪HUMMLC2B基因的基因组DNA序列分析结果
• 4.4 表达谱分析结果
• 4.4.1 总RNA的提取和检测结果
• 4.4.2 猪CA3基因的时空表达谱分析结果
• 4.4.2.1 猪CA3基因的组织表达谱分析结果
• 4.4.2.2 猪CA3基因在骨骼肌发育不同时期的表达谱分析结果
• 4.4.3 猪HUMMLC2B的时空表达谱分析结果
• 4.4.3.1 HUMMLC2B基因的组织表达谱分析结果
• 4.4.3.2 HUMMLC2B基因在骨骼肌不同发育时期的表达谱分析结果
• 4.5 融合蛋白的亚细胞定位
• 4.5.1 猪CA3融合蛋白的亚细胞定位结果
• 4.5.2 猪HUMMLC2B融合蛋白的亚细胞定位结果
• 4.6 基因的多态性检测
• 4.6.1 猪CA3基因的遗传多态性检测
• 4.6.1.1 CA3基因G8603A位点的遗传多态性检测
• 4.6.1.2 CA3基因G8370A位点的遗传态性检测
• 4.6.1.3 G8371A和G8603A多态位点组成的单倍型分析
• 4.6.2 猪HUMMLC2B基因的遗传多态性检测
• 4.6.2.1 G1876A和T2005G位点的遗传多态性检测结果
• 4.6.2.2 T1513C位点的遗传多态性检测结果
• 4.6.2.3 G1094A位点的遗传多态性检测结果
• 4.6.2.4 T1513C、G1876A和T2005G位点组成单倍型的分析结果
• 4.6.2.5 C2672T、C2691T、C2731T和C2840T位点多态性检测结果
• 4.7 猪基因多态与部分性状的关联分析
• 4.7.1 CA3基因多态性与部分性状的关联分析
• 4.7.1.1 CA3基因G8603A位点多态与部分性状的关联分析
• 4.7.1.2 CA3基因G8371A位点多态与部分性状的关联分析
• 4.7.2 猪HUMMLC2B基因多态.与部分性状的关联分析
• 4.7.2.1 T2005G位点不同基因型与部分性状的关联分析
• 4.7.2.2 G1876A位点不同基因型与部分性状的关联分析
• 4.7.2.3 T1513C和G1094A位点多态与部分性状的关联分析
• 5 讨论
• 5.1 关于新基因定位
• 5.2 关于SNPs检测
• 5.3 关于Real—time PCR技术
• 5.3.1 PCR引物及TaqMan探针的设计
• 5.3.2 扩增条件的优化
• 5.3.3 表达谱的数据分析
• 5.4 关于基因的表达谱分析
• 5.4.1 猪CA3基因的表达谱分析
• 5.4.2 猪HUMMLC2B基因的表达谱分析
• 5.5 关于亚细胞定位
• 5.5.1 细胞的染色
• 5.5.2 HUMMLC2B融合蛋白在细胞中的位置
• 5.6 关于猪CA3基因的分析
• 5.7 关于HUMMLC2B的基因组结构分析
• 5.8 关于基因与性状的关联分析
• 5.8.1 猪CA3基因多态与性状的关联分析
• 5.8.2 猪HUMMLC2B基因多态与性状的关联分析
• 5.9 SNPs分型技术用于近交程度的检测
• 6 小结
• 参考文献
• 附录
• 附录1 缩略词表
• 附录2 主要性状的中英文对照和缩写
• 在读期间发表论文题录
• 致谢