论文摘要
体细胞克隆技术的出现及其与基因打靶技术的结合为哺乳动物的基因工程和基因组保存提供了新的理念和手段。猪是人异种器官移植理想的器官来源。体细胞核移植为人们生产不引起免疫排斥以及无内源性病毒的供体猪提供了可能。虽然体细胞克隆猪在几个国家已经取得成功，但其克隆效率仍较低（＜1％）。本研究以建立高效的猪体细胞核移植体系为目的，系统研究了影响核移植效率的因素，通过优化技术，改善培养条件，达到稳定大量地生产克隆胚胎，并进行胚胎移植以期获得克隆猪的出生。利用组织块法建立了广西巴马香猪的40d胎儿成纤维细胞系、成年耳成纤维细胞系，以机械刮取法建立了输卵管上皮细胞系，并分离培养了猪卵泡液中的颗粒细胞系。研究了冻存对胎儿成纤维细胞的影响以及胎儿成纤维细胞的生长曲线和染色体倍性。实验结果表明，冻存后的胎儿成纤维细胞仍能保持良好的生长状态，细胞生长曲线呈典型的s型，在传代10次之前，染色体倍性正常的比例在92％以上。以猪卵巢卵母细胞为研究对象，进行卵母细胞体外成熟培养，对影响该技术的几项重要因素即卵母细胞状态、培养基、体外培养时间、培养基添加物进行研究分析，结果表明：（1）来源于不同直径和不同分级的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在体外成熟能力中差异显著，直径3～6mm卵泡COCs成熟率为81.2％，大于6mm卵泡COCs成熟率80.6％，均显著高于小于3mm卵泡COCs成熟率（65.5％，P＜0.05）；A级与B级第一极体（PB1）排出率无明显差异，两者均极显著高于C级（P＜0.01），三者成熟率分别为：80.7％，79.3％，26.0％。（2）成熟培养液NCSU-23的成熟培养效果略高于TCM199（80.6％，79.8％，P＞0.05）；（3）不同成熟培养时间对体外成熟效果影响显著，体外成熟44h，成熟率明显高于40h和48h，分别为81.4％，61.2％，66.2％（P＜0.05），极显著高于36h（7.3％，P＜0.01）；（4）在NCSU-23成熟培养液中添加EGF，rPGH对成熟效率影响不大；添加不同直径卵泡液对卵母细胞体外成熟具有促进作用（添加组：84.2％，83.7％，未加组：55.8％），添加组成熟率显著高于未添加组（P＜0.05）。经多次孤雌激活实验表明，以山梨糖醇为激活液的效果优于甘露醇，300V／mm、20μs、3DC与200V／mm、60μs、1DC的孤雌激活卵裂率和囊胚率都显著高于其他组；电激活后分别在成熟培养液中添加2mmol／L 6-DMAP或2mg／ml CB进行化学处理，所得卵裂率、囊胚率上均无明显差异，但CB组死卵率较高；20μmol／L离子霉素激活处理40min激活效果最好；体外成熟培养36h、40h的卵母细胞在卵裂率和囊胚率上明显不如44h、48h，成熟培养44h的卵母细胞卵裂率最高可达85.5％，48h囊胚率最高为44.9％。比较了盲吸法、挤压去核法以及spindle-view去核法（极化显微镜去核法），表明spindle-view法的去核率可以达到95.5％，是一种安全、高效的去核方法。以胎儿成纤维细胞和成年耳成纤维细胞作为供核体细胞构建的重构胚后期发育效果良好；10代以内的胎儿成纤维细胞更有利于重构胚的发育，融合率、卵裂率和囊胚率都很高。200V／mm，60μs，1DC电激活后，在以B2为培养基的培养体系中进行培养，无论在重构胚的融合率、卵裂率和囊胚率上均为最高（87.2％、79.3％、28.7％），但与NCSU-23差异不显著。从实验成本考虑，采用传统的NCSU-23培养基是可行的。在以上实验的基础上，对实验室获得的早期重构胚胎（1～4细胞胚胎）进行了手术法胚胎移植。截至出稿时，已移植受体母猪16头，第一批预实验6头20～22天均返情；第二批克隆胚胎移植受体上海白猪10头，有3头超过两个情期（45天）未返情。