论文摘要
仙鱼汤是广东省名医、广州中医药大学陈锐深教授所创建的中药复方,自拟治疗肺癌的中药经验方。希望通过此次的实验探讨,能验证中药复方仙鱼汤具有多靶点抗肿瘤侵袭和转移的机制。目的1.分析仙鱼汤（XYT）对于小鼠Lewis肺癌细胞的凋亡、迁移和侵袭活性的影响。2.探讨仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌细胞降解细胞外基质（ECM）的相关基因,基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及组织基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）的表现量影响。3.利用动物模型观察仙鱼汤抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长及转移。方法1.仙鱼汤（XYT）浓度配置:不同浓度XYT实验组【低（XYTL）=1.092g/ml,中（XYTM）=2.184g/ml,高（XYTH）=4.368 g/ml】。药剂量之给与参考临床用药量,根据人与动物体表面积计量换算法计算,分别相当于临床剂量的1、2、4倍。2.体外培养小鼠Lewis肺癌细胞,随机分为4组:对照组（CG）,不同浓度仙鱼汤低（XYTL）、中（XYTM）、高（XYTH）实验组。各组不同处理因素作用48小时后,以倒置光学显微镜观察小鼠Lewis肺癌细胞生长密度及形态变化;用流式细胞仪分析细胞周期并检测肺癌细胞凋亡率;用四氮唑盐（MTT）比色法检测肺癌细胞增殖及体外生长活性:以BoydenChamber观察肺癌细胞迁移。3.肺癌动物模型备制:复苏Lewis肺癌细胞株:将培养的肺癌细胞（Lewis lung carcinoma 1×106/ml）悬浮液0.2ml,接种于BALB/C小鼠左后肢内外侧骼骨区皮下进针。接种后第2天按照体重随机分4组,每组10只,各组为:荷瘤模型组（CG）,不同仙鱼汤浓度低XYTL、中XYTM、高XYTH实验组。XYT每日灌胃1次,连续14天,末次给药后24小时,Lewis肺癌小鼠颈椎脱臼处死。剥离瘤组织称重,以观察肿瘤大小、重量,计算肿瘤平均瘤重与瘤肿抑制率。并作小鼠常规石蜡切片,HE染色观察瘤组织病理学变化及转移至肺部的能力。同时采用SABC免疫组化法检测肺癌组织中MMP-2/TIMP-2的表达分析。4.统计学分析:所有数据将由计算机统计软件SPSS统计软件分析。实验所得所有数据以均值±标准差（（?）±s）表示,多组间的数据比较用方差分析（Anova）,两两比较用q检验,P＜0.05有统计学显着性差异。结果综合观察荷瘤模型组/对照组及实验组:1.一般状态观察:实验结束后,发现荷瘤模型组小鼠表现身材瘦小,活动少,喜群居,毛发缺少光泽;但各仙鱼汤实验组脱毛现象少于荷瘤模型组,活动力优也于荷瘤模型组。2.瘤肿抑制率观察:瘤肿抑制率=（1-实验组平均瘤重/荷瘤模型组平均瘤重）×100%。各仙鱼汤实验组肿瘤的生长明显受到抑制,肿瘤重量均低于荷瘤模型组,差异均有显着性意义（P＜0.01）。不同浓度仙鱼汤的抑瘤率分别为XYTL:32.31%、XYTM:36.25%、XYTH:40.88%;实验组随着仙鱼汤剂量的增加,瘤重逐渐减轻。3.小鼠Lewis肺癌细胞生长密度及形态观察:荷瘤模型组细胞生长密集,细胞形态清晰,细胞间连接丰富。实验组则密度降低,细胞间隙增大,细胞间连接减少,细胞体积变小,透光度降低,细胞出现皱缩,少量细胞变圆漂浮。说明仙鱼汤可抑制肺癌细胞的生长,促进细胞的凋亡。随着加样浓度增大,细胞皱缩飘起增多。4.HE染色观察肺肿瘤细胞的形态:从荷瘤模型组可看到典型肺肿瘤细胞的形态。细胞大小与形态很不一致可见瘤巨细胞。瘤细胞核体积增大,细胞核与细胞浆比例增大,核的大小、形态、染色不一,可见巨核、多核,核染色深,核染色质呈粗颗粒状,分布不均匀。核仁肥大,数目增多,核分裂相增多,间质内淋巴细胞少见。不同剂量仙鱼汤组中可见癌巢内坏死面积增大,间质可见淋巴细胞等炎症细胞浸润,亦可见较多的细胞凋亡小体。5.各仙鱼汤组可显着降低肺癌细胞MTT-OD值,抑制细胞增殖。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%。其抑制率分别为XYTL:12.12%、XYTM:16.39%、XYTH:21.15%。肺癌细胞的增殖抑制率,随着仙鱼汤浓度的升高而增加。6.以Boyden Chamber观察其迁移率分别为XYTL:130±15%、XYTM:97±11%、XYTH:85±9%。在XYTM与XYTH迁移率可见较明显的下降（P＜0.01）。7.以流式细胞仪（FCM）作细胞周期（Cell Cycle）及凋亡（Apoptosis）分析:发现各仙鱼汤组在G0/G1期与对照组相比,不同仙鱼汤浓度组均可增高肺癌细胞之G0/G1期细胞比例,有显着性差异（P＜0.01）。XYTL与XYTH相比,亦存有差异性（P＜0.05）。肺癌细胞在S期细胞数目比例明显减少,且各组间均有显着差异性（P＜0.01）。在G2/M期,各组间差异不大（P＞0.05）。实验表明,仙鱼汤可通过干扰、延缓或阻滞肺癌细胞使S期细胞比率下降,G1期细胞比率增加,细胞凋亡增多,对Lewis肺癌细胞有生长抑制作用,且呈剂量依赖性,进一步起到抗癌作用,对肺癌的治疗有重要意义。而由FCM测得的细胞凋亡率改变,显示在XYTM、XYTH中,可见到肺癌细胞的凋亡率明显增高,对照小鼠Lewis肺癌细胞生长密度及形态观察,两者相互印证。8.经SABC免疫组织化学染色,将荷瘤模型组及各实验组中MMP-2、TIMP-2的平均积分光密度做方差分析;当荷瘤模型组（CG）与XYTH相比（P＜0.01）,说明两者有非常显着的差异。当XYTL与XYTM相比（P＞0.05）,说明XYTL与XYTM之间没有差异。除此之外,其它各组间均有差异（P＜0.01）,说明XYT实验组肯定有起到抗肺癌转移作用的意义。仙鱼汤可以使小鼠Lewis肺癌细胞中的MMP-2的表达降低,使TIMP-2的表达增强,从而起到抗肺癌侵袭转移的作用。尤其在XYTH中,TIMP-2的高度表达,可能相对抑制了MMP-2的表达,并使MMP-2水平明显降低。此结果给予我们在寻求最佳治疗剂量上,以求达到最大治疗效果,给于有价值的考量。结论癌细胞的转移往往是造成癌症病人病灶复发致死及最难根治的主要原因,其过程包括细胞的贴附、细胞外基质的降解及细胞转移能力的改变。因此,在很多研究中,大都是以针对癌细胞的转移过程,开发新药或是利用天然药物观察是否会影响癌细胞的转移。中医药抗肺癌转移的研究近年来虽然取得了一些成绩但总的来说仍处于探索阶段。在分子生物学上的研究报道较少,许多报道都只停留在粗浅的观察上,且过分重视对单味药的抗癌成分研究,忽视了运用中医理论—辨证施治、四诊合参来进行中药复方抗肺癌转移的探究。传统中药使用以复方为主,但随着药理学的发展,许多中药的有效成分已经被确定。由众多文献证实,中药的确具备许多功效,无论在抗病毒、抗菌、抗发炎、抗过敏、预防癌症及抗癌效果,皆有明显的功效。中医药抗肺癌的有效成分之作用机转,是通过提高宿主免疫系统功能、降低血液粘度、影响肿瘤细胞周期以及诱导肿瘤细胞发生凋亡等方式来抑制肺癌细胞生长,阻断肺癌发生转移,但至今对其系统生物学方面的研究尚少。经过此次实验总结论为:1.中药抗癌的有效成分之作用机转,为有效地促使细胞凋亡,以及抑制癌细胞增生、侵袭和转移。仙鱼汤能抑制小鼠Lewis肺癌的生长、增殖、侵袭和转移,其机制可能与阻滞细胞周期进程、促进细胞凋亡有关。2.MMPs/TIMPs的平衡在维持ECM的动态平衡中具有重要地位,在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用,为肿瘤早期浸润的标志。仙鱼汤可抑制小鼠Lewis肺癌的增殖与迁移能力,其机制可能与抑制MMP-2与提高TIMP-2表达有关。3.MMPs/TIMPs平衡系统的发生机制在恶性肿瘤衍生中仍然保留,因肿瘤的演进,恶性潜能增强,MMPs合成分泌增多,但是会同时激活MMPs的抑制系统,诱导升高TIMPs的合成和分泌,以求达到新的平衡。TIMPs在肿瘤的升高是MMPs升高的伴随现象,或者认为是一种代偿反应。鉴于TIMPs对肿瘤的双重性,保持效应部位之高表达极为重要,否则作用可能适得其反。如高表达TIMP-2抑制肿瘤细胞生长,低表达则刺激生长。高浓度仙鱼汤组可明显提高TIMP-2的表达,其机制可能与高表达的TIMP-2能有效完全抑制MMP-2表达有关,并进一步起到抗癌作用,对肺癌的治疗与XYT新剂型的开发有重要意义。由于研究是从抗增殖,细胞周期阻滞,促凋亡,控制转移能力4个方面进行,因此认为XYT对LLC细胞的抗肿瘤作用是多途径的,实验也验证了中药复方仙鱼汤具有多靶点抗肿瘤的效果。经由本实验显示,也得知XYTH有助明显提高TIMP-2高表达的特异性,因此,提示我们应进一步探讨仙鱼汤高浓度剂量对治疗肺癌的研究与其在各关键生化数据及基因上的表现,或许更有助于未来仙鱼汤新剂型与剂量的开发。
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