基于质谱技术的蛋白质组学方法对食品蛋白质糖基化的研究

论文摘要

本论文主要采用基于生物质谱技术的蛋白质组学方法,包括傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、多级质谱以及氢氘交换质谱技术（HDX-MS）研究了食品蛋白质的内部结构和外在加工条件对蛋白质糖基化的影响机制,并对糖基化蛋白质的构象进行解析；采用一整套蛋白质组学的方法,包括全体蛋白质的提取分离、蛋白质的鉴定,应用SDS-PAGE技术、胶内酶解技术以及超高效液相色谱ˉ多维质谱联用技术对蛋清中的蛋白质组分进行鉴定,并对其中各组分的糖基化程度和位点进行鉴定,结果表明：（1）卵清蛋白的二硫键被还原后其结构被破坏导致其糖基化程度提高,在干热状态下,其糖基化肽段从6增加到11个,在溶液状态下从1增加到2个；且高反应物浓度和能量传递效率导致干热反应糖基化程度远远高于湿热反应；通过鉴定糖基化位点发现卵清蛋白的糖基化位点主要是赖氨酸残基；通过结合卵清蛋白的三维结构,发现其糖基化位点受多种因素的影响,包括蛋白质的空间结构、氢键以及相邻氨基酸的组成；卵清蛋白经还原后再糖基化提高了蛋白质的乳化性和泡沫性质。（2）卵清蛋白与食品加工过程中常见的四种还原糖在高温溶液中反应,通过测定反应产物的性质发现,卵清蛋白ˉ葡萄糖和卵清蛋白ˉ麦芽糖体系的褐变程度、还原力和DPPH清除力最大；而卵清蛋白ˉ葡萄糖和卵清蛋白ˉ乳糖体系具有较高的TEAC值,是制备抗氧化剂的一种有效方式；卵清蛋白ˉ糖在溶液中反应后其产物的抗氧化性质与其褐变程度具有一定的相关性,颜色越深,抗氧化活性越高；不同的糖基化产物的热力学性质不同,糖基化可以改变卵清蛋白的热稳定性。（3）将卵清蛋白与葡萄糖在一定的条件下反应后使其部分糖基化,通过胃蛋白酶酶解后采用高分辨率质谱和串联质谱技术鉴定蛋白质的糖基化程度及其位点,再采用氢氘交换质谱技术研究糖基化后蛋白质构象的变化。结果表明,糖基化后的卵清蛋白经氢氘交换后大部分肽段被保护,表明糖基化后蛋白质的结构趋于稳定；卵清蛋白糖基化和非糖基化的区域构象均发生变化,表明糖基化不仅可以影响其糖基化位点局部的构象变化,而且可影响其远处的构象。（4）DHPM预处理可以促进蛋白质的糖基化反应,提高BSA的糖基化程度并增加糖基化位点；100MPa下的DHPM预处理对BSA的糖基化影响最大,糖基化位点由7个增加至11个,大部分肽段的DSP值在100 MPa时最大；糖基化反应结合高分辨率的质谱分析可以用来探测压力诱导的蛋白质的构象变化；DHPM诱导的蛋白质去折叠以及糖基化反应的加快表明DHPM为食品加工过程中糖基化反应的控制提供了一种有效方法。（5）采用氢氘交换质谱的方法研究不同条件DHPM对BSA构象的影响,结果表明BSA经DHPM处理后BSA结构被破坏,总体结构变松散,结构域II和III趋于去折叠状态,结构域I被保护,趋于稳定；不同压力处理导致其去折叠程度不同,在100MPa时,去折叠程度最大；肽段的去折叠程度与糖基化程度相关,与上章中糖基化程度和糖基化位点结论基本一致。（6）蛋清蛋白中含有47种不同的蛋白质,分子量分布很广,从4248到275408Da；部分蛋白质以不同的形式存在,或与小分子形成复合物的形式存在,说明天然的蛋清蛋白中部分蛋白质组分存在各种修饰；蛋清蛋白糖基化过程中中只有部分组分被糖基化,且各组分的糖基化程度各不相同,其主要组分中,卵转铁蛋白较易被糖基化,溶菌酶较难被糖基化,糖基化位点主要为K。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 引言
• 1.1 食品蛋白质的糖基化修饰
• 1.1.1 食品蛋白质的糖基化方法
• 1.1.1.1 干热法
• 1.1.1.2 湿热法
• 1.1.2 蛋白质糖基化的影响因素
• 1.1.2.1 内在反应条件
• 1.1.2.2 外在加工条件
• 1.1.3 糖基化蛋白质的结构
• 1.2 基于生物质谱的蛋白质组学方法
• 1.2.1 生物质谱技术简介
• 1.2.1.1 质谱分析的基本原理
• 1.2.1.2 质谱的离子源
• 1.2.1.3 质谱的裂解技术
• 1.2.2 FTICR-MS简介
• 1.2.3 氢氘交换质谱
• 1.3 生物质谱技术在食品蛋白质中的应用
• 1.4 本论文的研究意义
• 1.5 本论文的主要研究内容
• 1.6 本课题的主要创新点
• 第2章 二硫键对蛋白质糖基化的影响机理
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 卵清蛋白的还原
• 2.2.3.2 干热反应样品的制备
• 2.2.3.3 湿热反应样品的制备
• 2.2.3.4 乳化性的测定
• 2.2.3.5 泡沫性质的测定
• 2.3.3.6 样品的酶解
• 2.3.3.7 高效液相-质谱（HPLC-MS）分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 功能性质
• 2.3.2 糖基化程度分析
• 2.3.3 糖基化位点的鉴定
• 2.4 本章小结
• 第3章 卵清蛋白与不同糖在高温湿热下的糖基化反应
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 卵清蛋白糖基化样品的制备
• 3.2.3.2 紫外吸收和褐变程度的测定
• 3.2.3.3 自由氨基含量的测定
• 3.2.3.4 热力学性质
• 3.2.3.5 内源荧光光谱的测定
• 3.2.3.6 抗氧化性的测定
• 3.2.4 数据分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 紫外吸收和褐变程度
• 3.3.2 自由氨基含量
• 3.3.3 热力学性质
• 3.3.4 内源荧光光谱
• 3.3.5 还原力
• 3.3.6 DPPH清除力
• 3.3.7 Trolox当量抗氧化能力（TEAC值）
• 3.4 本章小结
• 第4章 氢氘交换质谱研究卵清蛋白糖基化后的构象变化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料与设备
• 4.2.2 样品制备
• 4.2.3 糖基化肽的鉴定
• 4.2.3.1 样品酶解
• 4.2.3.2 液相-质谱分析
• 4.2.4 氢氘交换实验
• 4.2.4.1 氢氘交换、液相-质谱实验装置和肽的鉴定
• 4.2.4.2 氢氘交换-质谱实验
• 4.2.5 数据分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 卵清蛋白的糖基化位点
• 4.3.2 糖基化程度
• 4.3.3 糖基化蛋白质的构象变化
• 4.4 结论
• 第5章 动态高压微射流对蛋白质糖基化的影响机理
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验仪器
• 5.2.3 实验方法
• 5.2.3.1 DHPM改性
• 5.2.3.2 糖基化反应
• 5.2.3.3 吸光度的测定
• 5.2.3.4 样品的酶解
• 5.2.3.5 高效液-质谱分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 褐变程度
• 5.3.2 糖基化位点的鉴定
• 5.3.3 DHPM对BSA糖基化程度的影响
• 5.3.4 DHPM处理后BSA构象的变化
• 5.4 本章小结
• 第6章 氢氘交换质谱研究BSA经DHPM改性后的构象
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料与仪器
• 6.2.2 DHPM处理
• 6.2.3 氢氘交换实验
• 6.2.3.1 氢氘交换、液相-质谱实验装置和肽的鉴定
• 6.2.3.2 氢氘交换-质谱实验
• 6.3 数据分析
• 6.4 结果与讨论
• 6.5 结论
• 第7章 蛋白质组学方法鉴定蛋清蛋白及其各组分的糖基化差异
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 试剂与仪器
• 7.2.1.1 材料与试剂
• 7.2.1.2 实验仪器
• 7.2.2 样品制备
• 7.2.3 蛋白质的提取
• 7.2.4 SDS-PAGE
• 7.2.5 酶解
• 7.2.6 HPLC-LTQ-MS/MS
• 7.2.7 数据搜索
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 蛋清蛋白的鉴定
• 7.3.2 蛋清蛋白的糖基化鉴定
• 7.4 本章小结
• 第8章 结论与展望
• 8.1 引言
• 8.2 结论
• 8.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间的研究成果