昆虫杆状病毒表达的狂犬病毒G蛋白间接ELISA检测方法的研究

论文摘要

狂犬病是由狂犬病毒引起的重要的人兽共患病,是迄今为止人类病死率最高的急性传染病,人和动物一旦发病,死亡率几乎是100%。野生动物是本病的主要天然储存宿主,犬是人狂犬病的最主要传染源。近年来该病在我国的发生呈逐年上升的趋势,已成为严重危害我国公共卫生的重大疫病。随着动物国际贸易需求的增加,为控制全球日益严峻的狂犬病疫情,国家与国家之间对于进出境口岸的犬、猫等动物也要进行严格的检疫监管,要求动物必须接种狂犬病疫苗,并且中和抗体效价要高于国际标准（0.5 IU/ml）才允许其进出境。因此世界卫生组织和国际兽疫局（OIE）把这一国际单位（0.5 IU/ml）作为疫苗免疫后血清中和抗体效价的最低标准。但是由于各国的疫苗种类、质量、工艺、所用的佐剂以及免疫时间、次数不同,即使已经免疫的动物也存在着中和抗体的差异,因此急需建立一种更加快速的方法来检测免疫动物的中和抗体水平。现有的狂犬病中和试验操作繁琐,需时较长,要求条件高,不适宜口岸快速检测的需求,因此急需建立一种与进出境检验检疫相适应的快速、敏感、特异的方法来代替中和试验。酶联免疫吸附试验方法因其敏感、特异、快速,因而在进出境口岸动物疫病检验检疫中得到了广泛应用。目前国内外已有报道用ELISA方法可以检测狂犬病毒抗体,但是针对狂犬病毒中和抗体检测方法的研究未见报道。本研究利用己纯化的狂犬病毒糖蛋白作为包被抗原,通过条件优化,建立了间接ELISA方法,并用该方法对狂犬病疫苗免疫后不同时期血清中的中和抗体进行检测。条件优化后,间接ELISA方法各项反应参数如下:抗原包被量为0.3μg/ml;包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清的最佳稀释倍数为40倍;HRP-兔抗犬IgG的最佳工作浓度为1:2000;最佳封闭液采用1%浓度的卵清蛋白;封闭条件为37℃,2h;血清样品的稀释液选用1%浓度的卵清蛋白;酶标抗体的稀释液也选用1%浓度的卵清蛋白。待检血清,酶标二抗的反应时间均为1h,底物反应的时间为10min。阴阳临界值确定为0.252。之后,利用OIE指定的检测狂犬病毒中和抗体的方法,即荧光抗体病毒中和试验与ELISA进行对比,分别利用两种方法对疫苗免疫后不同时期的376份犬血清进行检测和分析,结果用荧光抗体病毒中和试验检测,有299份为阳性,77份为阴性,而用间接ELISA方法检测,有282份为阳性,94份为阴性。间接ELISA方法的特异性为100%,敏感性为94.31%,与荧光抗体病毒中和试验结果的符合率为95.48%。经统计学方法分析,两种方法的差异不显著,从而进一步证实建立的间接ELISA方法的优点及实用价值,这也为解决口岸狂犬病毒中和抗体检测中的难题奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一篇 文献综述
• 第一章 狂犬病概述及其流行状况分析
• 1.1 狂犬病病毒的分类地位
• 1.2 狂犬病病毒的理化特性
• 1.3 狂犬病病毒的传染源
• 1.4 狂犬病病毒的传播途径
• 1.5 世界各地狂犬病的流行状况
• 第二章 狂犬病病毒的分子生物学研究进展
• 2.1 狂犬病病毒的基因组结构
• 2.2 狂犬病病毒粒子的结构
• 2.3 狂犬病病毒基因编码的蛋白结构和功能
• 2.4 狂犬病的诊断及防制
• 2.5 狂犬病动物中和抗体检测的应用
• 2.6 研究的目的和意义
• 第二篇 实验研究
• 第一章 荧光抗体病毒中和试验的建立
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二章 间接ELISA方法的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三章 荧光抗体病毒中和试验和间接ELISA方法的比较
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介