首页> 正文

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因在真核细胞中的表达及应用实验研究

2020-11-22阅读(451)

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因在真核细胞中的表达及应用实验研究

论文摘要

传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）主要侵害雏鸡中枢免疫器官法氏囊,导致以免疫抑制为主的淋巴细胞衰竭综合症,造成对多种病原的易感性增加和其他疫苗的免疫失败。传统IBD人工免疫主要是弱毒苗和灭活苗免疫,但自80年代以来出现的IBDV变异株和超强毒株给该病的防治带来了困难。DNA疫苗因能诱导机体产生全面的免疫应答而成为疫苗学研究领域的焦点,但由于其诱导产生的免疫应答的效果还不够理想,因此如何增强其免疫效果成为目前DNA疫苗研究的关键问题。 本研究小组在前期工作中已证实了IBDV多聚蛋白（VP2/4/3）DNA疫苗具有良好的免疫原性,可诱发机体产生满意的免疫保护效果,而且ChIL-2（Chicken Interleukin 2）能够增强IBDV DNA疫苗免疫效果。在此基础上,本研究通过基因融合技术构建了IBDVVP2/4/3和ChIL-2的融合基因真核表达质粒,利用ChIL-2的分子免疫佐剂效应来增强IBDV DNA疫苗的免疫效果。由于目前对质粒DNA在真核细胞中的表达及影响其表达产物分泌的因素还不甚清楚,因而不能对融合基因表达质粒中基因连接位置进行优化,本研究将ChIL-2分别置于IBDV VP2/4/3的N端及C端,进行了两种方式的基因融合。应用重叠延伸剪切技术（splicing by overlapping extension）,分别经三次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-IL-2、IL-2-VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得含有IBDV VP2/4/3和ChIL-2融合基因的真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,从而使IBDVVP2/4/3与ChIL-2基因能够在同一细胞内得到表达,以避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例,从而高效地发挥ChIL-2的分子免疫佐剂作用。同时在扩增VP2/4/3-IL-2和IL-2-VP2/4/3融合基因时,引物中设计了包含编码15个低疏水性及低电荷效应的氨基酸序列（G4S）3作为接头,甘氨酸结构简单,易于折叠,对融合蛋白的空间构象影响小,并保持其天然生物学活性。 在脂质体介导下,将融合基因真核表达质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3分别转染Vero细胞进行表达。RT-PCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;FITC标记的山羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验（IPA）可检测到特异性的黄绿色荧光。通过SDS-PAGE检测转染72h后的细胞裂解液,pCI-IL-2-VP2/4/3的表达产物在60KD、56KD以及30KD处均可检测到特异性条带,pCI-VP2/4/3-IL-2的表达产物在48KD、44KD和42KD处也可检测到特异性的条带,但均未见与VP4蛋白分子量大小相对应的条带。而后相同的样品进行Western-blot鉴定,以免源IBDV抗血清为一抗,pCI-IL-2-VP2/4/3

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 第一部分 文献综述
  • 第一章 传染性法氏囊病病毒的分子生物学研究进展
  • 1、IBDV的基因组结构及编码的蛋白
  • 1.1 5’-NCR和3’-NCR
  • 1.2 病毒的蛋白
  • 2、IBDV的形态和结构
  • 3、病毒抗原漂移与毒力变异的分子机制
  • 4、IBDV的复制和繁殖
  • 5、IBDV新型疫苗研究进展
  • 5.1 重组亚单位疫苗
  • 5.2 重组活载体疫苗
  • 5.3 基因缺失疫苗
  • 5.4 病毒样颗粒（VLPs）
  • 5.5 高压力失活疫苗
  • 5.6、DNA疫苗的研究
  • 6、目前存在的问题及对策
  • 第二章 DNA疫苗免疫效应增强策略研究进展
  • 1、DNA疫苗的组成及作用机理
  • 1.1 DNA疫苗的组成和功能
  • 1.2 DNA疫苗的作用机制
  • 2、DNA疫苗免疫效应的增强策略
  • 2.1 目的基因的筛选
  • 2.2 载体的合理设计
  • 2.3 抗原表达量的提高
  • 2.4 抗原免疫原性的增强
  • 2.5 合适投递系统的选择
  • 2.6 基因免疫佐剂的运用
  • 2.7 优化免疫方案
  • 2.8 融合基因DNA疫苗
  • 3、展望
  • 第二部分 研究内容
  • 第一章 IBDVVP2／4／3-ChIL-2融合基因真核表达载体构建
  • 1 材料
  • 1.1 载体、宿主菌
  • 1.2 试验试剂
  • 2 方法
  • 2.1 融合基因的PCR扩增
  • 2.2 重组质粒pCI-VP2／4／3-IL-2、pCI-IL-2-VP2／4／3的构建
  • 2.3 重组质粒pCI-VP2／4／3-IL-2、pCI-IL-2-VP2／4／3的鉴定
  • 3 结果
  • 3.1 引物设计和PCR扩增目的基因
  • 3.2 融合基因真核表达质粒的构建
  • 3.3 重组质粒的鉴定
  • 4 讨论
  • 第二章 IBDVVP2／4／3-ChIL-2融合基因真核表达质粒在Vero细胞中的表达
  • 1 材料
  • 1.1 载体、质粒、宿主菌
  • 1.2 试验试剂
  • 2 方法
  • 2.1 融合基因重组质粒的鉴定与扩增
  • 2.2 转染级超纯度真核表达质粒的制备
  • 2.3 脂质体介导pCI-VP2／VP4／VP3转染Vero细胞
  • 2.4 间接免疫荧光抗体法检测蛋白的表达
  • 2.5 RT-PCR检测融合基因的表达
  • 2.6 SDS-PAGE
  • 2.7 Western blotting
  • 3 结果
  • 3.1 重组质粒转染后细胞形态学变化
  • 3.2 RT-PCR检测融合基因转录
  • 3.3 重组质粒在Vero细胞中的瞬时表达
  • 3.4 SDS-PAGE及Western-blot检测抗原的免疫反应性
  • 4 讨论
  • 第三章 IBDVVP2／4／3-ChIL-2融合基因DNA疫苗免疫原性研究
  • 1 材料
  • 1.1 病毒株、质粒
  • 1.2 试验试剂
  • 2 方法
  • 2.1 真核表达质粒的大量制备
  • 2.2 质粒DNA的纯化、鉴定和定量
  • 2.3 试验动物分组及免疫
  • 2.4 IBDV母源抗体的检测
  • 2.5 抗IBDV血清ELISA抗体水平的测定
  • 2.6 中和抗体的测定
  • 2.7 淋巴细胞增殖反应的测定
  • 2.8 动物攻毒保护试验
  • 2.9 法氏囊病理学观察及统计学分析
  • 3 结果
  • 3.1 血清抗IBDV抗体水平的测定
  • 3.2 病毒中和试验
  • 3.3 DNA疫苗各试验组诱导的外周血淋巴细胞增殖效果观察
  • 3.4 DNA疫苗各试验组对强毒的攻击保护效果观察
  • 3.5 法氏囊病理组织学检查
  • 4 讨论
  • 第三部分 附录
  • 附录一：英文缩写及中英文对照
  • 附录二：质粒图谱
  • 附录三：常用试剂及配制
  • 附录四：攻读硕士期间发表或录用的学术论文
  • 附录五：致谢

    • 相关论文文献

    • [1].基于科学思维的“DNA是主要的遗传物质”教学设计[J]. 教育观察 2019(30)
    • [2].基于粪便DNA的贺兰山岩羊亲权鉴定和婚配制研究[J]. 生态学报 2019(22)
    • [3].通过调节蛋白酶K消化时长优化DNA提取方法[J]. 生物化工 2019(06)
    • [4].蛹虫草线粒体DNA与细胞核DNA进化关系的比较[J]. 微生物学报 2019(12)
    • [5].有毒有机物影响DNA酶解和抗生素抗性基因横向迁移[J]. 农业环境科学学报 2020(01)
    • [6].蓝莓栽培品种的DNA条形码[J]. 林业科学 2019(12)
    • [7].应用于多个沉香属物种鉴定的DNA条形码序列筛选[J]. 中国药学杂志 2019(23)
    • [8].抗核抗体和抗双链DNA检测在系统性红斑狼疮诊断中的意义[J]. 中国医疗器械信息 2019(23)
    • [9].幽门螺旋杆菌诱导的胃腺癌DNA甲基化基因修饰研究进展[J]. 中国老年保健医学 2019(06)
    • [10].DNA分析技术在法医物证鉴定中的应用[J]. 法制博览 2020(03)
    • [11].磁性纳米颗粒负载质粒DNA的研究[J]. 华南农业大学学报 2020(01)
    • [12].DNA智慧扶贫工作室教育扶贫策略与实践[J]. 科技风 2020(06)
    • [13].家畜冷冻精液DNA的纯化及影响因素分析[J]. 南京农业大学学报 2020(02)
    • [14].蝙蝠蛾拟青霉及金水宝胶囊的DNA条形码鉴定[J]. 中国实验方剂学杂志 2020(08)
    • [15].3种DNA分子标记法联合鉴别草珊瑚及其混伪品[J]. 中草药 2020(03)
    • [16].探讨无创DNA检测和羊水细胞染色体检查的意义[J]. 中国卫生标准管理 2020(03)
    • [17].乳头状甲状腺癌中线粒体DNA突变的研究[J]. 中国细胞生物学学报 2020(01)
    • [18].非标记表面增强拉曼光谱在DNA检测中的应用[J]. 激光生物学报 2020(01)
    • [19].彗星电泳检测草胺磷对蚯蚓体腔细胞DNA的损伤[J]. 广东农业科学 2020(01)
    • [20].基于DNA检测的肉制品鉴伪技术研究进展[J]. 食品工业科技 2020(08)
    • [21].绵羊血液中布氏杆菌DNA提取方法的比较研究[J]. 畜牧与兽医 2020(03)
    • [22].环境DNA在水体中存留时间的检测研究——以中国对虾为例[J]. 渔业科学进展 2020(01)
    • [23].云斑白条天牛成虫不同组织部位DNA提取方法比较[J]. 滨州学院学报 2019(06)
    • [24].三七片DNA条形码分子鉴定及方法学考察[J]. 中草药 2020(07)
    • [25].DNA倍体分析系统在脱落细胞学及术中病理诊断中的应用[J]. 中国农村卫生 2020(03)
    • [26].DNA免疫吸附治疗重度活动性系统性红斑狼疮的疗效观察[J]. 中国社区医师 2020(07)
    • [27].红肉猕猴桃再生体系的建立及DNA条形码鉴定[J]. 植物生理学报 2020(03)
    • [28].蛋白质精氨酸甲基转移酶1调控DNA损伤修复和细胞凋亡[J]. 海洋科学 2020(03)
    • [29].基于密度梯度离心技术分离稳定同位素DNA的方法研究[J]. 实验科学与技术 2020(02)
    • [30].基于DNA链置换的可满足性问题的计算模型[J]. 阜阳师范学院学报(自然科学版) 2020(01)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  

    IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因在真核细胞中的表达及应用实验研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5