逆转录病毒介导法将SV40LT基因导入中国对虾淋巴细胞的初步研究

论文摘要

近年来由于对虾病害的威胁,对虾养殖产业的发展受到了严重的影响。为了深入研究对虾病毒和发展有效的疾病防治策略,建立对虾细胞系的要求日益迫切。本文采用逆转录病毒介导的方法将细胞转化基因-猿猴病毒大T抗原基因（SV40LT）导入培养的中国对虾（Penaeus Chinensis）淋巴细胞（lymphoid cells）中,尝试对其进行转化培养。本研究旨在探索对虾细胞体外培养的可行技术,为对虾细胞的建系工作奠定基础。从携带SV40LT基因的质粒pLLTSN中高保真PCR扩增出2.1 Kb的SV40LT基因,将其插入到泛嗜性逆转录病毒载体（pantropic retroviral vector）pLXRN的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间,构建重组载体pLXRN-SV40LT。酶切分析和测序验证结果表明,载体插入基因的位置、大小、序列均正确,成功构建重组泛嗜性逆转录病毒表达载体pLXRN-SV40LT。采用磷酸钙沉淀法将重组载体pLXRN-SV40LT与包装质粒pVSV-G共转染GP2-293细胞,病毒包装48小时后收集上清。经NIH3T3细胞测定,重组病毒的滴度为4×106 cfu/ml。以重组病毒感染原代培养的中国对虾淋巴细胞,经G418筛选阳性细胞后传代培养。细胞培养结果表明,转基因细胞株具有贴壁能力下降,从壁上脱落的细胞可悬浮生长等转化细胞的特征,传至10代时,其生长状态和分裂势头仍很好,而对照细胞只能传至3代;转基因细胞株传至12代时因真菌污染而丢失。PCR法检测第10代转基因细胞株基因组中的SV40LT基因,结果表明成功扩增出270 bp SV40LT片段,证实转基因细胞株基因组中较稳定的含有SV40LT基因;采用端粒重复序列扩增法（TRAP）分析转基因细胞株的端粒酶活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,转基因细胞株的端粒酶活性明显高于原代对照细胞,这从一个侧面反映了转基因对虾细胞株获得了转化的特性。本研究有希望发展成为建立对虾永生化细胞系的可行技术,同时为探索其他海洋无脊椎动物细胞的建系方法提供了有益的借鉴。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 对虾细胞体外培养研究的现状
• 2.1 培养组织的选择
• 2.2 培养基与添加因子的选择
• 2.3 培养条件的选择
• 3 对虾细胞的转化研究策略
• 3.1 对虾细胞转化研究概况
• 3.2 SV40LT 基因与细胞转化
• 3.2.1 SV40 大T 抗原的结构与功能
• 3.2.2 SV40LT 基因介导细胞永生化转化的机制
• 3.2.3 SV40LT 基因在细胞转化中的应用
• 3.3 转基因方法
• 3.3.1 逆转录病毒载体
• 3.3.2 腺病毒载体
• 3.3.3 腺相关病毒载体
• 3.3.4 脂质体转染
• 3.3.5 电脉冲介导
• 3.3.6 壳聚糖载体
• 4 立题依据及意义
• 4.1 立题依据
• 4.2 研究意义
• 4.2.1 在对虾病害研究中的应用
• 4.2.2 在虾病毒药物筛选中的应用
• 4.2.3 在对虾细胞生物学研究中的应用
• 第二章 重组逆转录病毒载体的构建及逆转录病毒的包装
• 1 实验用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 几种常用溶液的配方
• 2 实验方法
• 2.1 SV40LT 基因的扩增
• 2.2 重组逆转录病毒载体的构建
• 2.3 逆转录病毒的包装
• 3 实验结果
• 3.1 重组逆转录病毒载体的鉴定
• 3.2 逆转录病毒的包装与滴度测定结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三章 将SV40LT基因导入对虾细胞的初步研究
• 1 实验用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 几种常用溶液的配方
• 2 实验方法
• 2.1 中国对虾淋巴细胞的基因转导
• 2.2 目的基因的检测
• 2.3 转基因对虾细胞端粒酶活性的检测
• 3 实验结果
• 3.1 转基因对虾细胞培养结果
• 3.2 外源基因检测结果
• 3.3 端粒酶活性检测结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢