论文摘要
破骨细胞是导致骨质吸收的主要细胞，体外培养破骨细胞是研究骨吸收与抑制骨吸收药物作用机理的基本方法，本研究分别采用Chambers破骨细胞培养法和骨髓诱导培养法体外培养破骨细胞，通过观察活体细胞、HE染色、TRAP染色及骨吸收陷窝甲苯胺兰染色鉴定破骨细胞，并用不同浓度的中药淫羊藿苷进行干预，探讨了淫羊藿苷对成熟破骨细胞骨吸收功能和其凋亡的影响以及对破骨细胞诱导生成的作用，同时本研究应用RT-PCR技术，研究了淫羊藿苷对破骨细胞β肌动蛋白、TRAP、RANK、CK、MMP-9 mRNA表达的影响，从而对淫羊藿苷的药物作用靶点及其与基因调控的关系进行了探讨。为此本研究完成了以下3个实验：实验1：淫羊藿苷对体外培养兔成熟破骨细胞骨吸收功能和凋亡的影响。采用Chambers破骨细胞培养法，体外分离培养乳兔成熟破骨细胞，与玻片及骨磨片共同培养，用10-7mol／L、10-6mol／L、5×10-6mol／L、10-5mol／L浓度的淫羊藿苷刺激破骨细胞。倒置相差显微镜下观察活体细胞、HE染色、TRAP染色及骨吸收陷窝甲苯胺兰染色鉴定破骨细胞，并进行骨吸收陷窝计数和面积测量，吖啶橙染色观察凋亡破骨细胞所占的比例，结果表明：与空白对照组比较10-6mol／L、5×10-6mol／L、10-5mol／L浓度的淫羊藿苷组破骨细胞凋亡率均明显增高，骨吸收陷窝数目、面积明显减少，随浓度增加抑制作用增强，差异有显著性（P＜0.05）。实验2：淫羊藿苷对小鼠骨髓源性破骨细胞诱导生成及骨吸收功能的影响。采用骨髓诱导培养法，用终浓度分别为25ng╱ml、30ng╱ml、10-8mol／L的M-CSF、RANKL、1，25（OH）2VitD3体外诱导培养小鼠骨髓源性破骨细胞，在此过程中加入终浓度分别为0、10-7mol／L、10-6mol／L、10-5mol／L的淫羊藿苷。倒置相差显微镜下观察活体细胞、HE染色、TRAP染色及降钙素受体染色鉴定破骨细胞，计数骨片上骨吸收陷窝数及面积，玻片上TRAP阳性多核细胞数，结果显示：加药组随淫羊藿苷浓度的增加，骨片上形成的骨吸收陷窝数及面积，玻片上的TRAP阳性多核细胞数呈量的依赖性的减少，与非加药组比较，10-6mol／L、10-5mol／L浓度的淫羊藿苷组，差异有显著性（P＜0.05）。实验3：淫羊藿苷对体外培养小鼠破骨细胞β肌动蛋白、TRAP、RANK、CK、MMP-9 mRNA表达的影响。用浓度分别为25ng／ml、30ng╱ml、10-8mol／L的M-CSF、RANKL、1，25（OH）2VitD3体外诱导培养小鼠骨髓源性破骨细胞，分别加入0、10-5 mol／L的淫羊藿苷，培养48h后，抽提总RNA，采用半定量RT-PCR法检测破骨细胞中β肌动蛋白、TRAP、RANK、CK、MMP-9 mRNA表达的变化。结果显示：与空白对照组比较，10-5 mol／L的淫羊藿苷可明显下调β肌动蛋白、RANK、MMP-9 mRNA的表达（P均＜0.05），但对TRAP、CK mRNA的表达无明显影响（P均＞0.05）。综合以上实验结果本研究得出如下结论：1、淫羊藿苷具有抑制体外培养破骨细胞骨吸收功能的作用。2、淫羊藿苷具有促进体外培养破骨细胞凋亡的作用。3、淫羊藿苷具有抑制体外RANKL、M-CSF和1，25（OH）2WitD3诱导的骨髓源性破骨细胞生成的作用。4、淫羊藿苷可下调体外培养破骨细胞β肌动蛋白mRNA的表达，这可能与抑制破骨细胞生成及骨吸收有关。5、淫羊藿苷可下调体外培养破骨细胞RANK、MMP-9 mRNA的表达，说明淫羊藿苷可能通过作用于RANK介导的核因子κB信号转导通路，抑制破骨细胞分化成熟及骨吸收功能。