论文摘要
目的:胃癌的腹膜种植转移是影响胃癌患者预后的重要原因之一。文献报道在胃癌术后复发的类型中,腹膜种植约占50%,目前其发生机制尚不明确,且缺乏行之有效的防治手段。趋化因子受体CXCR4（CXC chemokine receptor4,CXCR4）是组织表达最为广泛的趋化因子受体之一。研究发现CXCR4的异常活化与乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等恶性肿瘤发生发展密切相关,肿瘤细胞可能通过活化的CXCR4信号影响肿瘤的发生发展进程,但CXCR4与胃癌侵袭转移的关系如何,经系统文献检索至今尚未见报道,鉴于此,本课题首先观察胃癌不同组织中CXCR4的表达及其与胃癌临床病理参数之间的关系,随后构建CXCR4-siRNA慢病毒载体转染胃癌细胞MKN-45,以特异抑制胃癌细胞MKN-45中CXCR4的表达,观察其阻抑效应;再建立裸鼠胃癌腹膜种植转移模型,观察胃癌细胞腹膜种植转移的变化情况,由此揭示CXCR4在胃癌腹膜种植转移中的作用及可能机理,为胃癌腹膜种植转移防治提供新思路。方法:1.收集90例外科手术切除胃癌标本和30例正常胃组织,应用免疫组组织化学方法检测CXCR4、SDF-1和VEGF-C的表达,系统分析它们与临床病理参数之间的关系,研究三者在胃癌不同组织中的表达与胃癌侵袭转移的关系。2.构建CXCR4-siRNA慢病毒载体并直接感染胃癌细胞株MKN-45。实验分成6组:正常对照组（SDF-1α阴性）、正常对照组（SDF-1α阳性）、空病毒载体组（SDF-1α阴性）、空病毒载体组（SDF-1α阳性）、CXCR4-siRNA载体转染组（SDF-1α阴性）、CXCR4-siRNA载体转染组（SDF-1α阳性）。采用MTT试验、流式细胞、趋化实验（Transwell小室法）、RT-PCR、Western blot等技术,比较研究了CXCR4-siRNA慢病毒载体转染前后及SDF-1作用前后细胞增殖、细胞凋亡、细胞趋化的变化和对胃癌细胞株MKN-45胞浆VEGF-C、NRP-1表达的受抑程度。3.建立人胃癌细胞裸鼠腹腔种植转移模型,观察CXCR4-siRNA慢病毒载体对胃癌细胞裸鼠腹腔种植转移的影响。结果:1. CXCR4阳性表达主要在胃癌细胞的细胞膜和/或细胞质中。在90例胃癌原发灶、71例胃癌转移的淋巴结和9例腹膜转移灶中表达率分别为83.33%（75/90）、90.14% （64/71）和100%（9/9）,30例正常胃组织中未见CXCR4表达。VEGF-C阳性表达主要在癌细胞的细胞质,正常胃组织中VEGF-C表达阳性率为6.67%（2/30）;胃癌组织中VEGF-C表达阳性率80.00%（72/90）,胃癌转移淋巴结中VEGF-C阳性率为91.55% （65/71）。而胃癌腹膜转移中VEGF-C阳性率为100.00%（9/9）,与前四组相比,具有显著性差异（P<0.01或P<0.05）。SDF-1阳性表达主要位于癌细胞胞质和胞浆内。SDF-1在正常胃组织中的表达呈强阳性,阳性率为93.33%（28/30）;SDF-1在胃癌组织中的阳性表达率明显降低,胃癌组织中SDF-1阳性表达率68.89%（62/90）,胃癌淋巴结转移中SDF-1阳性表达率42.25%（30/71）,胃癌腹膜转移组织中SDF-1阳性表达率11.11%（1/9）,与正常胃组织相比,差异均具有显著性（P<0.01或P<0.05）。CXCR4、SDF-1和VEGF-C在胃癌原发灶中的表达与肿瘤的分期、浸润深度、分化程度及淋巴结转移相关（r=0.337,P<0.05）,与病人的年龄、性别、肿瘤的部位及大小无相关性（P>0.05）。结果表明肿瘤的浸润深度、肿瘤的大小和原发灶中CXCR4、SDF-1的表达构成了胃癌淋巴结和腹膜转移的危险因素。2.成功构建了CXCR4-siRNA慢病毒载体。CXCR4-siRNA慢病毒载体直接感染胃癌细胞MKN-45后,细胞生长受到明显抑制,抑制作用呈时间依赖性;转染后细胞周期分布中,G0/G1期比例增高,而S期和G2/M期比例降低,细胞的增殖指数亦明显降低（P<0.05）,细胞的凋亡指数明显增加（P<0.01）,显著抑制胃癌细胞MKN-45的趋化运动能力（P<0.01）和VEGF-C、NRP-1的表达（P<0.01）。3.建立各转染组胃癌细胞裸鼠腹腔种植转移模型,CXCR4-siRNA慢病毒载体转染组与对照组、空病毒组裸鼠比较,腹水产生时间、腹水量、腹膜种植瘤最大直径、最大重量、种植瘤数目、生存时间、存活率、生命延长率相比均有显著性差异（P<0.01或P<0.05）;CXCR4-siRNA慢病毒载体组肿瘤抑制率为59.58%;种植瘤细胞周期分布情况:CXCR4-siRNA慢病毒载体组与对照组、空病毒组细胞比较,G0/G1期比例增高,而S期和G2/M期比例降低,细胞的增殖指数降低,凋亡显著增加（P<0.05或P<0.01）。而对照组和空病毒组细胞周期相比,无明显变化（P>0.05）。结论:1.研究表明CXCR4和VEGF-C在胃癌组织中特异性高表达,与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、临床分期及肿瘤转移,尤其腹膜种植转移呈显著相关。随病变进展,CXCR4和VEGF-C在胃癌组织中的表达呈现逐渐上调的趋势,其中腹膜转移灶中表达最强,二者在胃癌组织中的表达具有显著相关性,胃癌腹膜种植转移可能是胃癌细胞分泌的CXCR4促进VEGF-C的活性升高所引起。2.胃癌细胞MKN-45特异性高表达CXCR4 mRNA与蛋白,与胃癌侵袭转移显著相关;CXCR4-siRNA慢病毒载体能显著抑制MKN-45细胞中CXCR4 mRNA及蛋白的表达,显著降低胃癌细胞MKN-45的增殖和侵袭能力,升高凋亡率,并显著下调VEGF-C、NRP-1的表达,结果表明CXCR4-siRNA慢病毒载体体外显著抑制胃癌细胞的侵袭转移,体内动物实验显著抑制胃癌腹腔种植转移。CXCR4促进VEGF-C活性升高可能是导致胃癌腹膜种植转移重要的分子机理之一。3. CXCR4-siRNA慢病毒载体可显著抑制裸鼠胃癌腹腔种植瘤的形成和腹水产生,显著延长裸鼠生存时间,降低其死亡率。同时可显著增加种植瘤细胞G0/G1期细胞比率（P<0.01）和凋亡率（P<0.01）;显著降低G2/M期细胞比率和增殖PI值（P<0.05）;并且随CXCR4-siRNA作用时间延长,胃癌细胞凋亡率和G0/G1期细胞比率呈上升趋势,而G2/M期细胞比率和PI值呈下降趋势,结果表明CXCR4-siRNA可能通过阻断胃癌细胞进入增殖周期,抑制其增殖,诱导其凋亡升高可能是CXCR4-siRNA慢病毒载体抑制胃癌腹腔侵袭转移的作用机制之一。