牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素检测技术研究

论文摘要

金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是引起食物中毒的主要病原菌之一,同时也是引起奶牛乳房炎及多种临床化脓性感染的主要病原菌,其快速检测技术一直是研究热点。目前,国内检测金葡菌仍采用传统的方法,其操作繁琐,检测时间长,而且灵敏性、特异性均较低。本研究建立了快速检测乳品中金葡菌及其肠毒素的PCR方法,提高了检测方法的灵敏性,缩短了检测时间,为金葡菌引起的食源性疾病的快速检测诊断提供技术支持。本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因,选择特异性引物,进行PCR扩增,检测乳品中的金黄色葡萄球菌。在此基础上,使用自行设计的简并引物SEAB检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B, SEA与SEB的PCR产物长度分别为105bp和135bp。对其PCR扩增产物克隆后进行了DNA测序,得知与靶基因序列的同源性都高达99%,从而证实该产物为目的产物。使用简并引物SEAB检测SEA、SEB菌株DNA结果呈阳性,4株对照菌株的检测结果呈阴性,证实了该引物具有良好的特异性；SEB的检测下限为2.0×103cfu/ml, SEB的DNA最低检测浓度为3.58ng/μl。本研究还建立了快速检测乳品中常见致病菌沙门氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法。结果显示,3对引物能同时特异地扩增出495bp、360bp和279bp的目的片段；对3株菌的检测限分别为1.9×102cfu/ml,2.0×102cfu/ml,2.9×102cfu/ml;3株菌DNA含量的最低检出限分别为3.86pg/μl,25.5pg/μl,3.47pg/μl。本研究使用nuc基因的引物及SEA、SEB的简并引物SEAB检测乳品的模拟试验与其它快速检测方法相比较,结果显示,使用PCR方法检出率为81.7%; Petrifilm RSA方法检出率为78.3%；国标法检出率为81.7%。在使用简并引物SEAB检测的50份生牛乳中有3份被检出含有SEA,有6份被检出含有SEB,有4份含有SEA和SEB,产毒素率为26.5%,肠毒素基因的检出率比较高。多重PCR检测生牛乳的模拟试验并与国标方法相比较,结果显示,两种方法的检出率分别为：46.7%、53.3%、50.0%。可知两种方法的检测结果完全一致,验证了M-PCR方法具有良好的可行性和实用性,显示出该方法具有较好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 研究意义及目的
• 1.2 金黄色葡萄球菌简介
• 1.2.1 金黄色葡萄球菌生物学特性
• 1.2.2 金黄色葡萄球菌致病性
• 1.2.3 金黄色葡萄球菌的流行病学
• 1.2.4 金黄色葡萄球菌污染的控制
• 1.3 金黄色葡萄球菌检测方法
• 1.3.1 常规检测方法
• 1.3.2 快速检测方法
• 1.4 PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素的研究进展
• 1.4.1 PCR技术
• 1.4.2 常规PCR
• 1.4.3 多重PCR
• 1.4.4 逆转录PCR
• 1.4.5 荧光定量PCR
• 1.4.6 PCR技术与其它技术的结合
• 1.5 研究内容及技术关键
• 第二章 金黄色葡萄球菌DNA的提取及PCR检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 金黄色葡萄球菌培养结果
• 2.2.2 金黄色葡萄球菌DNA提取方法的比较与优化结果
• 2.2.3 PCR方法检测金黄色葡萄球菌
• 2.3 小结
• 第三章 PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器设备
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 PCR反应条件优化结果
• 3.2.2 测序结果
• 3.2.3 简并引物SEAB的特异性分析
• 3.2.4 简并引物SEAB的灵敏性分析
• 3.3 小结
• 第四章 多重PCR检测沙门氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 仪器设备
• 4.1.3 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 特异性分析
• 4.2.2 多重PCR反应条件的优化
• 4.2.3 多重PCR引物的灵敏性试验
• 4.3 小结
• 第五章 生乳及乳制品中金黄色葡萄球及其肠毒素的检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 仪器设备
• 5.1.3 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 乳品中金黄色葡萄球菌DNA的提取结果
• 5.2.2 简并引物检测金黄色葡萄球菌与其它方法比较的结果
• 5.2.3 多重PCR与国标法比较的结果
• 5.3 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 硕士期间参与的科研项目及成果
• 致谢