甜椒甘油—3—磷酸酰基转移酶基因的分离及功能研究

论文摘要

膜脂不饱和度与植物抗冷性关系密切。高等植物抗冷能力与叶绿体膜脂中磷脂酰甘油（PG）的顺式不饱和脂肪酸水平密切相关,抗冷植物中PG 的sn-1 位具有较高比例的顺式不饱和脂肪酸,而冷敏感植物中顺式不饱和脂肪酸比例则较低。甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）是叶绿体中PG 生物合成过程中的第一个酰基酯化酶,它将脂肪酰转移到3-磷酸甘油的C-1 位上合成1-酰基-Sn-甘油-3-磷酸（溶血磷脂酸）。一般来说,抗冷植物中GPAT 优先选择C18:1-ACP 作为底物,因此在这些植物的叶绿体中PG 的sn-1 位置上就含有较高比例的18:1 脂肪酸,这些脂肪酸可以在酰基脂肪酸去饱和酶的作用下进一步去饱和化成为顺式多聚不饱和脂肪酸;然而在冷敏感植物中,GPAT 很难区分C18:1-ACP 和C16:0-ACP,由于16:0 脂肪酸不能被进一步去饱和形成不饱和脂肪酸,结果这些植物中PG 的sn-1 位顺式不饱和脂肪酸含量较低,从而对低温胁迫敏感。本文以甜椒为实验材料,利用反转录PCR（RT-PCR）克隆了甜椒甘油-3-磷酸酰基转移酶的基因,通过同源性比较证明所克隆的基因是目的基因。根据获得的基因序列制备了杂交探针,分析了该基因在甜椒中的表达特征。构建了GPAT 基因的正义和反义表达载体,并通过农杆菌介导的叶盘法转入烟草中,探讨了温度逆境条件下GPAT 基因的功能。主要结果如下: 1. 利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR 的方法从甜椒茄门中克隆到了甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的中间片段,然后通过3’-RACE 和5’-RACE 分别克隆到了甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的3’片段和5’片段,拼接后设计特异引物扩增到甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的全长cDNA,利用RT-PCR 方法首次从甜椒叶片中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的cDNA

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 低温对喜温植物光合作用的影响
• 1.2 低温对膜的影响
• 1.3 膜脂不饱和度与植物抗寒性的关系
• 1.4 不饱和脂肪酸的生物合成
• 1.5 膜脂不饱和度与植物抗寒性关系的分子生物学研究进展
• 1.6 本文的研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料与处理
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.2.1 甜椒的处理
• 2.1.2.2 烟草的处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 利用 TRIZOL 试剂盒提取 RNA
• 2.2.2 RNA 反转录
• 2.2.3 甜椒甘油-3-磷酸酰基转移酶基因全长的克隆
• 2.2.3.1 中间片段的获得
• 2.2.3.2 3’RACE获得3’端序列
• 2.2.3.3 5’RACE 获得5’端序列
• 2.2.3.4 GPAT 基因全长的克隆
• 2.2.4 甜椒 GPAT 基因的克隆及测序
• 2.2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4.2 连接
• 2.2.4.3 转化及克隆筛选
• 2.2.4.4 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.4.5 质粒 DNA 的酶切鉴定
• 2.2.4.6 序列测定
• 2.2.5 Northern 杂交
• 2.2.5.1 RNA 提取及电泳
• 2.2.5.2 转膜及烘膜
• 2.2.5.3 探针合成
• 2.2.5.4 预杂交、杂交及放射自显影
• 2.2.6 表达载体的构建
• 2.2.6.1 碱法大量提取质粒 DNA
• 2.2.6.2 载体构建
• 2.2.7 电泳目的基因片段的回收
• 2.2.8 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.8.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.8.2 冻融法转化农杆菌
• 2.2.8.3 利用农杆菌介导转化烟草
• 2.2.9 转基因烟草植株的 PCR 检测
• 2.2.9.1 CTAB 法微量法提取基因组 DNA
• 2.2.9.2 转基因植株的 PCR 筛选
• 2.3 转基因烟草生理指标的测定
• 2.3.1 转基因烟草叶片膜脂含量的测定方法
• 2.3.2 光合气体交换参数的测定
• 2.3.3 荧光参数测定
• 3 结果与分析
• 3.1 甜椒 GPAT 基因的克隆
• 3.1.1 甜椒叶片 RNA 的提取及反转录
• 3.1.2 基因中间片段的克隆
• 3.1.3 GPAT 基因3'端的克隆
• 3.1.4 GPAT 基因5'端的克隆
• 3.1.5 GPAT 基因全长的克隆
• 3.2 基因序列同源性分析
• 3.2.1 核苷酸序列分析
• 3.2.2 氨基酸序列分析
• 3.2.3 CaGPAT氨基酸序列的系统树分析
• 3.3 甜椒 GPAT 基因表达特性分析
• 3.3.1 甜椒 GPAT 基因在不同器官中表达特性
• 3.3.2 低温和高温处理不同时间下甜椒 GPAT 基因的表达特性
• 3.3.3 不同温度处理下甜椒 GPAT 基因的表达特性
• 3.4 CaGPAT 基因转化烟草
• 3.4.1 正义表达载体 PBI-GPATP 和反义表达载体 PBI-GPATN 的构建
• 3.4.2 构建正向表达载体时的 PCR 检测
• 3.4.2.1 对克隆载体的检测
• 3.4.2.2 对正义表达载体的检测
• 3.4.3 构建反义表达载体时的 PCR 检测
• 3.4.3.1 对克隆载体的检测
• 3.4.3.2 对表达载体的检测
• 3.4.4 甜椒 GPAT 基因转化烟草及转基因植株的分子检测
• 3.4.5 转基因烟草植株生理功能分析
• 3.4.5.1 转基因烟草类囊体膜脂的变化
• 3.4.5.2 野生型和转基因烟草光合速率对低温的响应
• 3.4.5.3 低温下野生型和转基因烟草荧光参数的变化
• 3.4.5.4 高温胁迫对野生型及转基因烟草光合速率的影响
• 4 讨论
• 4.1 甜椒 GPAT 基因及其同源基因之间的序列分析
• 4.2 甜椒 GPAT 基因表达特性分析
• 4.3 转基因烟草生理功能分析
• 4.3.1 转基因烟草叶片中膜脂脂肪酸组成发生改变
• 4.3.2 转 CaGPAT 降低了烟草的抗冷性而提高了其耐高温能力
• 4.3.3 PG 中不饱和脂肪酸对烟草光合机构的保护作用
• 4.4 进一步研究的设想
• 5 主要结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢