Bcl10转录调控的研究和抗Bcl10～+肿瘤药物的筛选

论文摘要

Bcl10是一种细胞凋亡调节因子,它位于染色体1P22,这是多个抑癌基因聚集的位置。本研究首先应用免疫组织切片染色和Western blot技术检测了Bcl10蛋白在多种肿瘤组织和三种肿瘤细胞中的表现率。结果发现:在应用Western blot检测三种肿瘤细胞的结果中,宫颈癌HeLa细胞和淋巴瘤CA46细胞都被检测到Bcl10蛋白的阳性反应,但是在293细胞中没有看见。在免疫组织化学染色实验中, Bcl10只是选择性地在特定几种肿瘤组织中出现,特别是MALT淋巴瘤。阳性反应的还有大肠癌、宫颈癌和乳腺癌。而p53蛋白几乎在所检测的样本中都出现了阳性反应,这包括MALT淋巴瘤、大肠癌、宫颈癌、乳腺癌、贲门癌和肝癌。因此我们认为Bcl10和p53不同,它是一个选择性表达的基因。特别是在MALT淋巴瘤中,不同的部位表达的情况也不一样,它和MALT淋巴瘤的形成有很大的关系。我们推测Bcl10表达的组织特异性和它的启动子有关系。为了研究Bcl10基因表达调控的分子机制,我们第一步是从Hela细胞中提取mRNA采用5’-RACE的方法经过反转录和巢式PCR确定Bcl10基因的转录起始点。利用www.genomatix.de中的转录因子扫描程序,分析可能存在的转录因子结合位点,用手工比对的方法剔除分析结果中可能存在的假阳性,筛选可能性比较大的转录因子的区域进行研究。第二步以正常人基因组为模板克隆了Bcl10基因的5’上游序列。在此基础上,制备了不同的重组体,分别连入pEGFPD表达载体和pGL3荧光素酶报告基因表达载体,转染Hela细胞48小时后分别观察绿色荧光蛋白和检测荧光素酶活性,确定Bcl10的启动子的位置。结果显示1)Bcl10基因的转录起始点位于ATG上游的189bp处。2)生物信息学分析发现Bcl10基因的上游调控序列缺少TATA-Box,有七个GC-box,一个CAATbox和多个转录因子的结合位点,包括AP-1等。3)在所制备的6个截短体中,发现在Hela细胞中, P2有比较强的转录活性,位于-477bp～+1bp处,这是启动子的基本转录片段。比P2更长的片段P4（-1893bp～+1bp）,有比较低的转录活性,提示该序列可能有负调控元件。在应用生物软件扫描分析Bcl10的启动区时,我们发现在-495bp– -56bp处,存在一个440bp的CpG岛。利用甲基化特异性PCR （ MSP）检测了Bcl10启动子区的甲基化状态。结果在12例MALT淋巴瘤组织中有一例检测出Bcl10基因的异常甲基化。Bcl10启动子区CpG岛过甲基化和MALT癌的发生、发展有关系。最后,我们希望筛选一个对Bcl10敏感的抗Bcl10+肿瘤的药物。利用对Bcl10蛋白有不同反应的Hela细胞和293细胞,作为很好的实验材料,筛选了3种不同比例的壳聚糖铜复合物。结果显示:壳聚糖铜复合物对Hela和293细胞具有很强的抗肿瘤活性。但是,和Hela细胞相比,壳聚糖铜复合物对293细胞更敏感,更有选择性。也就是说,壳聚糖铜复合物抑制293细胞生长的效果更好,尤以CTS–Cu（3 ）的抗肿瘤活性最强。我们推测,在Hela细胞中,Bcl10因为突变失去了抑癌功能,而且Bcl10的截短突变体还有利于肿瘤细胞的生长。另外,我们还发现壳聚糖铜复合物俘获S期的293细胞的能力。壳聚糖铜复合物筛选得到的十五肽序列在NCBI的数据库搜索相似序列,发现有一段序列与多药耐药相关蛋白1以及氨基酰-tRNA合成酶的序列同源性很高。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 BCL10 基因的研究进展和背景
• 1.1 BCL10 基因的结构
• 1.2 BCL10 蛋白的生物学功能
• 1.2.1 Bcl10 是细胞调亡的调节因子
• 1.2.2 野生型BCL10 抑制细胞的恶性转化
• 1.2.3 Bcl10 控制 B 细胞发育和功能
• 1.3 BCL10 是 MALT 淋巴瘤形成的关键
• 1.3.1 MALT 淋巴瘤
• 1.3.2 MALT 淋巴瘤中两种常见的染色体易位
• 1.4 BCL10 在淋巴细胞中激活 NFκB 通路
• 1.4.1 TCR 的结构
• 1.4.2 膜邻近信号的共受体结构（Proximal signaling components of antigen receptors）对TCR 活化信号影响
• 1.4.3 接头蛋白Bcl10 参与NFκB 的激活
• 1.4.4 BCR 激活的 NFκB 通路
• 第二章 肿瘤相关基因的转录调控和过甲基化研究进展
• 2.1 肿瘤形成的分子生物学基础
• 2.1.1 致癌基因
• 2.1.2 抑癌基因
• 2.1.3 肿瘤抑制基因的功能丧失、突变或不表达是致癌因素之一
• 2.1.4 肿瘤抑制基因丧失隐性表达功能的突变也是致癌的因素之一
• 2.2 肿瘤相关基因的转录调控
• 2.2.1 普通启动子作用机制
• 2.2.2 组织特异性转录调控序列的作用机制
• 2.3 肿瘤相关基因DNA 甲基化
• 2.3.1 DNA 甲基化作用在肿瘤发生中的作用
• 2.3.2 染色质的结构和DNA 甲基化紧密相关
• 2.4 本论文的研究背景和研究目的
• 第三章 BCL10 基因在肿瘤细胞中的表达和检测
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 图像分析系统
• 3.1.4 测量方法
• 3.1.5 统计学方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 Bcl10 蛋白在三种肿瘤细胞中的表达
• 3.2.2 Bcl10 蛋白和p53 蛋白在肿瘤组织中的表达
• 3.3 讨论
• 第四章 BCL10 启动子区的定位和活性分析
• 4.1 实验材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 Bcl10 转录起始点的确定
• 4.2.2 Bcl10 调控序列转录因子分析
• 4.2.3 Bcl10 上游调控区的克隆和序列鉴定
• 4.2.4 Bcl10 启动子检测载体的构建和检测
• 4.3 讨论
• 第五章 BCL10 启动子区甲基化的分析与状态检测
• 5.1 实验材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 实验方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 Bcl10 上游调控序列的生物信息学分析
• 5.2.2 Bcl10 启动子区甲基化的检测
• 5.2.3 临床病理特点
• 5.3 讨论
• 第六章 抗 BCL10肿瘤活性的壳聚糖铜复合物筛选
• 6.1 实验材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 噬菌体展示文库和试剂
• 6.1.3 主要仪器
• 6.1.4 实验方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 不同比例的壳聚糖铜聚合糖复合物的检测
• 6.2.2 细胞增殖检测
• 6.2.3 细胞周期的检测
• 6.2.4 壳聚糖铜复合物特异性结合15 肽的淘洗
• 6.2.5 以壳聚糖铜复合物筛选的相互作用短肽及序列
• 6.2.6 和壳聚糖铜复合物相互作用的短肽的序列分析
• 6.3 讨论
• 参考文献
• 研究工作总结和创新
• 博士研究生期间发表和待发表论文
• 致谢