鸡贫血病毒VP1、VP2基因在毕赤酵母中的共表达、及重组蛋白的分析

论文摘要

鸡贫血病毒（CAV）是圆环病毒科,环形病毒属的唯一病毒。主要侵害雏鸡的骨髓造血组织、胸腺、法氏囊等淋巴组织,致使雏鸡发生造血障碍和免疫抑制,对传染性病原体的易感性升高。CAV基因组共编码三种蛋白:衣壳蛋白VP1、其伴侣蛋白VP2、细胞凋亡素VP3。其中,VP1是主要的结构蛋白;VP2是辅助蛋白,辅助VP1折叠成正确的构象。CAV VP1和VP2蛋白能够刺激机体产生中和性表位,诱发中和反应,作为抗原蛋白用于研制防治鸡传染性贫血病（CIA）的重组基因工程疫苗。本研究将重组质粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2共同转入毕赤酵母GS115细胞中,通过带G418抗性平板的筛选获得阳性重组菌株,然后进一步对菌株进行PCR鉴定和甲醇诱导表达鉴定,通过对PCR鉴定结果,及对甲醇诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果的综合分析,确定获得的融合蛋白CAV VP1能够分泌表达,融合蛋白CAV VP2须经酵母细胞在破碎后释放;同时Dot-ELISA试验结果表明,得到的CAV VP1-VP2融合蛋白可以和CAV VP1及VP2单克隆抗体结台,并印证了非结构蛋白CAV VP2在病毒粒子组装过程中的重要辅助作用,结合Western blot试验结果说明,结构蛋白CAV VP1的表位是构象依赖型表位。实现了CAV VP1、CAV VP2在同一GS115酵母细胞中的共表达,成功构建了重组毕赤酵母基因工程菌GS115pPIC9K/CAV VP1-VP2株。将构建的GS115 pPIC9K/CAV VP1-VP2菌株进行小规模高密度发酵试验。通过优化发酵条件与目的蛋白表达产量的关系,确定重组毕赤酵母基因工程菌株表达CAVVP1及CAV VP2蛋白的最佳发酵条件为:30℃,pH 5.0,溶氧（DO）值40%,甲醇补料速度为7.5 ml/L·h,经72 h诱导后,最终OD600值可达到1200或更高,表达蛋白保存于-20℃。将5升基础盐发酵培养基（FBS）的发酵产物超高压破碎后,进行紫外分光光度计测量和聚丙烯酰胺凝胶薄层扫描,结果显示:目的蛋白CAV VP1-VP2的表达量为34.2mg/ml,占到菌体总蛋白量的30%:表明CAV VP1及CAV VP2蛋白在小规模高密度发酵试验中获得了高水平表达,实现了该菌株在廉价基础盐培养基中的高密度发酵,获得了高表达、高稳定性的CAV VP1和CAV VP2蛋白,充分发挥了毕赤酵母这一真核表达系统的优越性。按既定工艺进行了含有由GS115 pPIC9K/CAV VP1-VP2菌株表达的CAV VP1、CAVVP2蛋白的基因工程疫苗的发酵生产,发酵浓缩得到的产物制成疫苗,并对其进行安全性试验及免疫效力效力试验。将疫苗稀释成不同浓度,胸肌注射免疫10日龄SPF雏鸡,每组5只,观察21d后剖检,结果显示,该疫苗安全;将疫苗稀释成不同浓度,胸肌注射免疫10日龄SPF雏鸡,每组10只,对免疫前和免疫后采集保存的血清进行ELISA检验,结果显示,不但在免疫组血清中检测到抗体,而且抗体滴度随雏鸡日龄的增长呈上升趋势;同时,IFA检验结果显示,免疫组制得的多克隆抗体可以和感染CAV的MDCC-MSB1反应,可见较强荧光;免疫3周后进行CAV强毒攻毒,观察21天后剖杀,进行病理观察及切片检查,结果显示,对照组雏鸡的脏器有明显的病理变化,而免疫组的雏鸡无明显病理变化,PCR方法诊断结果为CAV阳性。以上检验结果表明,该疫苗具免疫效力,能够表现出较好的免疫保护性,为日后此种疫苗的工厂化生产创造了良好的条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第二章 CAV VP1和VP2在毕赤酵母中的共表达
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 溶液配制
• 2 实验方法
• 2.1 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化
• 2.2 重组酵母菌株的PCR鉴定
• 2.2.1 重组酵母基因组DNA的提取
• 2.2.2 PCR扩增鉴定
• 2.3 重组酵母菌株的诱导表达
• 2.3.1 对诱导表达蛋白的SDS-PAGE试验
• 2.3.2 对诱导表达蛋白的Dot-ELISA检测
• 2.3.3 对诱导表达蛋白的免疫印迹试验
• 3 结果
• 3.1 重组酵母菌株的PCR筛选
• 3.2 重组菌株诱导表达鉴定
• 3.2.1 表达蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.2.2 表达蛋白的Dot-ELISA分析
• 3.2.3 表达蛋白的免疫印迹分析
• 4 讨论
• 第三章 重组酵母基因工程菌株发酵工艺的优级化
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 溶液配制
• 1.4 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 发酵液中菌密度的测定
• 2.2 发酵液中目的蛋白浓度的测定
• 2.3 酵母菌株的诱导表达
• 2.3.1 酵母菌株在摇瓶中的小量培养诱导表达
• 2.3.2 酵母菌株在发酵罐中的高密度发酵表达
• 2.4 优化发酵表达的条件
• 2.5 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.6 发酵表达产物的浓缩
• 2.7 洗脱液的Dot-ELISA检测
• 3 结果
• 3.1 发酵罐中发酵条件的优化
• 3.2 酵母菌在发酵罐中的诱导培养
• 3.3 发酵液样品的SDS-PAGE电泳结果
• 3.4 洗脱液的Dot-ELISA检测结果
• 4 讨论
• 第四章 重组酵母菌株发酵产物的免疫保护性分析
• 1. 材料
• 1.1 菌株、血清、蛋白
• 1.2 主要试剂
• 1.3 检测用雏鸡、细胞和病毒
• 1.4 溶液配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 疫苗的制备
• 2.2 安全性试验
• 2.3 效力试验
• 2.4 血清的酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 2.5 肝脏的PCR检测
• 2.6 血清的间接免疫荧光检测
• 2.7 雏鸡的病理剖检
• 3. 结果
• 3.1 重组蛋白的安全试验
• 3.2 重组蛋白的免疫效力试验
• 3.2.1 酶联免疫吸附试验
• 3.2.2 病理学检验
• 3.2.3 PCR检测
• 3.2.4 间接免疫荧光检测
• 4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢