4株虎源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的遗传演化分析

论文摘要

2004年,从华北某动物园老虎体内分离和鉴定了4株H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)。致病指数测定结果表明,这4株病毒都是高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus, HP AIV)。用H5N1亚型AIV的特异性引物,成功地扩增出这4株流感病毒的8个基因片段的全序列。与1996～2007年间的其它的H5N1亚型AIV毒株进行比对,HA基因序列分析显示:这4株流感病毒的HA基因的裂解位点处连接肽序列符合H5N1亚型HP AIV的特征:T1毒株裂解位点处连接肽的第3位发生R到G的突变;在受体结合位点(RBS)区域内,4株病毒在98、133、136、137、153、183、186、190、194、226和228位点的氨基酸很保守。在155位上,T2、T3、T4毒株是G,T1毒株为R。NA基因序列分析显示:4株病毒的NA茎部都具有20个氨基酸的缺失。NS基因序列比对表明:4株病毒在NS蛋白氨基酸的80～84位有“AIASS”五个氨基酸缺失。基因遗传进化分析显示:4株病毒位于同一个基因群系,有很高的亲缘关系。与广东鸭源01GD毒株、湖北鸡源04HB毒株、韩国鸡源03Kor毒株具有核苷酸和氨基酸的最高同源性,亲缘关系最近。8段基因序列的遗传进化分析显示:4株毒株是重组病毒。综上,4株病毒均为H5N1高致病性禽流感病毒并且有传播给人的可能,需加以防治。并且4株病毒位于同一分支,均为重组病毒,对于疫苗的开发研究有指导意义。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、综述部分
• 1 禽流感的研究历史
• 2 病原学
• 2.1 病毒的分类和形态
• 2.2 病毒的结构和各个蛋白的功能
• 2.2.1 血凝素（Hemagglutinin，HA）
• 2.2.2 核蛋白（Nucleoprotein，NP）
• 2.2.3 神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）
• 2.2.4 基质蛋白（Matrix Protein，M）
• 2.2.5 非结构蛋白（NonstructuraI Protein，NS）
• 2.3 流感病毒致病性的分子基础
• 2.4 病毒的复制
• 2.5 HP AIV 对动物的致病性
• 3 人感染 H5N1 亚型 AIV
• 3.1 AIV 的人传播人
• 4 实验室诊断
• 4.1 病毒的分离和鉴定
• 4.2 RT-PCR
• 4.3 血清学
• 5 防治
• 5.1 预防
• 5.2 控制
• 5.3 抗病毒治疗
• 5.4 疫苗接种
• 6 本研究课题的目的意义
• 二、实验部分
• 实验 1： 4 株虎源 H5N1 亚型禽流感病毒的分离和鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 病料
• 2.2 鸡胚和血清
• 2.3 溶液
• 2.4 主要仪器和设备
• 2.5 病毒的分离
• 2.6 病毒的鉴定
• 2.6.1 血凝试验（HA）
• 2.6.2 血凝抑制试验（HI）
• 2.6.3 静脉接种致病指数（IVPI）的测定
• 3 结果
• 实验2：4 株 H5N1 亚型 HP AIV 的全基因序列测定和遗传演化分析
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 病毒
• 2.2 主要试剂和仪器
• 2.3 H5N1 亚型流感参考毒株
• 2.4 引物
• 3 方法
• 3.1 病毒 RNA 提取
• 3.2 RT-PCR
• 3.2.1 反转录反应
• 3.2.1.1 反转录反应液的配制
• 3.2.1.2 反转录反应条件
• 3.2.1.3 PCR 反应液的配制
• 3.2.1.4 PCR 反应条件
• 3.3 PCR 结果的琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 3.4 PCR 产物的纯化和测序
• 3.5 序列测定和分析
• 4 PCR 结果
• 4.1 T1 毒株结果
• 4.2 T2 毒株结果
• 4.3 T3 毒株结果
• 4.4 T4 毒株结果
• 5 4 株 H5N1 亚型 HP AIV 的基因序列分析
• 5.1 HA 基因序列分析
• 5.1.1 HA 基因核苷酸序列分析
• 5.1.2 HA 氨基酸序列分析
• 5.1.2.1 裂解位点处序列
• 5.1.2.2 糖基化位点分析
• 5.1.2.3 抗原位点分析
• 5.1.2.4 HA 受体结合位点（RBS）分析
• 5.2 NA 基因序列分析
• 5.2.1 NA 基因核苷酸序列分析
• 5.2.2 NA 基因氨基酸序列分析
• 5.2.2.1 糖基化位点
• 5.3 M 基因序列分析
• 5.4 NS 基因序列分析
• 5.5 NP 基因序列分析
• 5.6 PA 基因序列分析
• 5.7 PB1 基因序列分析
• 5.8 PB2 基因序列分析
• 6 4 株 H5N1 亚型 HP AIV 的遗传演化分析
• 6.1 T1 病毒的遗传演化分析
• 6.2 T2 病毒的遗传演化分析
• 6.3 T3 病毒的遗传演化分析
• 6.4 T4 病毒的遗传演化分析
• 7 讨论
• 7.1 HA 基因
• 7.2 NA 基因
• 7.3 NS 基因
• 7.4 PB2 单位点突变与病毒毒力
• 7.5 4 株 H5N1 亚型 HP AIV 基因的遗传演化
• 三、结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文