仿刺参微卫星DNA标记的筛选与应用及性别差异研究初探

论文摘要

1.利用FIASCO的方法构建了刺参(CA)n的微卫星DNA富集文库,检测结果证明该微卫星DNA文库的富集效率为56.3%。测序得到110条含有微卫星DNA的序列的克隆,共得到118个微卫星DNA位点,其中完美型的微卫星DNA共83个,占70.4%;非完美型的微卫星DNA共30个,占25.4%;复合型的微卫星DNA共5个,占4.2%。重复次数在5~9次之间的有88个,占73.5%,重复次数在10次以上的有29个,占24.8%。根据所分离的微卫星DNA序列,共设计了84对引物。结果表明FIASCO方法可以较好的应用于刺参微卫星DNA位点的分离。这些微卫星DNA标记的获得将为刺参群体遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、分子标记辅助育种等研究奠定良好的基础。2.利用设计的20对微卫星DNA标记引物对采自中国青岛、韩国木浦、韩国江陵、日本新泻以及俄罗斯海明崴5个地理群体的仿刺参以及美国沿海的八角参进行了微卫星DNA多态性筛选、遗传多样性水平以及遗传结构分析。结果表明,20个位点均表现出多态性,共检测出231个等位基因,各位点分别扩增得到3~20个等位基因,平均每个位点的等位基因数为11.6个。20个位点在6个群体中不同程度的偏离遗传平衡(p<0.05),所有群体在整体上均表现为杂合子缺失(Fis>0);5个仿刺参群体间的遗传相似系数在0.71以上,相似性较高,而仿刺参群体与八角参的相似性则较低。聚类分析结果表明,中国群体与韩国西海岸群体聚类成一支,而俄罗斯群体、韩国东海岸群体和日本群体聚类成另外一支,聚类的先后与它们在地理分布上的海域位置有一定的相关性。本研究所筛选的多态性微卫星DNA分子标记将为刺参群体遗传结构分析、刺参遗传连锁图谱构建和分子标记辅助育种研究提供基础。此外,不同群体刺参遗传结构的解析结果也为刺参良种选育相关研究提供基础数据。3.用攻毒的方法选出感病刺参和抗病刺参各15头,组成感病群体和抗病群体。用20对微卫星引物对两个群体刺参个体的基因组DNA进行扩增,卡方检验各等位基因在两个群体间出现频数的差异,得到与抗病正相关的特异性遗传标记3个,与抗病负相关的特异性遗传标记3个。用13对多态性引物对两个群体的遗传多样性水平及遗传结构进行了分析,结果发现,两个群体的遗传多样性水平均较高,抗病群体的遗传多样性水平要高于感病群体。两个群体间的遗传分化指数为0.0478,说明两个群体间存在轻度的遗传分化;两个群体间的遗传距离为0.1685,遗传相似性指数为0.8449。这些抗病相关的遗传标记将为刺参分子辅助育种提供数据支持。4.在刺参生殖季节采集刺参,采用组织学研究方法,以刺参体壁样品为对照,观察了雌雄刺参生殖孔及周围的肌肉组织,在雄参和雌参生殖孔及周围肌肉的横切及纵切切片中均发现了生殖管。雌雄刺参的生殖管在直径大小、横切形状及周围组织结构3方面均有不同。雄参的生殖管直径小,横切形状为圆形或心形,周围没有纤维状组织;刺参的生殖管直径大,横切形状为梭形,较大的生殖管周围有纤维状组织。本研究的发现为刺参性别鉴定技术提供了参考,为刺参生殖孔的形成以及性别分化机制等研究奠定了基础。5.利用AFLP技术,应用96对AFLP引物组合,对刺参雌雄基因组DNA进行检测,筛选与刺参性别相关的分子标记。实验中共扩增出2753个位点,未发现性别相关的特异性标记,发现了212个位点在雌性和雄性个体中出现的比例存在很大差异(大于50%),用这212个位点绘制刺参个体聚类图,表明这212个多态位点与刺参性别之间存在很大的相关性。本研究所积累的大量AFLP分析结果和数据,可作为刺参遗传背景资料,为刺参性别以及其他方面的进一步研究提供参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 遗传标记及其应用
• 1.1 遗传标记的概念
• 1.2 遗传标记的分类
• 1.3 目前常用的分子标记
• 2 微卫星DNA 标记及其应用进展
• 2.1 微卫星DNA 的概念、分类
• 2.2 微卫星DNA 的形成机理和功能
• 2.3 微卫星DNA 技术的基本原理
• 2.4 微卫星DNA 位点获得的方法
• 2.5 微卫星DNA 标记在水产动物中的应用
• 3 水产动物性别鉴别进展
• 3.1 水产动物性别决定机制
• 3.2 水产动物性别鉴别方法
• 3.3 水产动物性别相关分子标记筛选研究进展
• 第二章 仿刺参基因组微卫星DNA 分子标记的筛选
• 1 材料
• 1.1 样本来源与DNA 提取
• 1.2 试剂配制
• 1.3 主要软件
• 2 实验方法
• 2.1 小片段基因组文库的构建
• 2.2 微卫星DNA 的杂交筛选
• 2.3 连接与转化
• 2.4 阳性克隆的培养
• 2.5 含微卫星DNA 序列的重组子的筛选
• 2.6 测序与分析
• 3 结果
• 3.1 基因组DNA 提取结果
• 3.2 基因组DNA 的酶切结果
• 3.3 连接产物的PCR 扩增
• 3.4 基因组微卫星DNA 杂交筛选后的PCR 扩增结果
• 第三章 不同自然地理群体海参遗传多样性分析
• 1 材料
• 1.1 样品采集及DNA 的提取
• 1.2 主要试剂的配制
• 1.3 主要软件
• 2 实验方法
• 2.1 微卫星DNA 引物的设计
• 2.2 微卫星DNA 引物的溶解
• 2.3 微卫星DNA 引物扩增条件的摸索
• 2.4 多态性检测及不同地理群体仿刺参的遗传多样性分析
• 2.5 数据统计及分析
• 3 结果
• 3.1 微卫星DNA 引物设计及扩增条件摸索结果
• 3.2 多态性检测及不同地理群体海参的遗传多样性分析结果
• 3.3 不同地理群体间的遗传结构分析
• 第四章 仿刺参抗病相关微卫星DNA 标记筛选
• 1 材料
• 1.1 样品采集及筛选
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要软件
• 2 方法
• 2.1 基因组DNA 提取
• 2.2 PCR 反应体系
• 2.3 PAGE 电泳
• 2.4 数据统计与分析
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增以及PAGE 电泳结果
• 3.2 两个群体的特异性位点
• 3.3 多态性检测以及遗传多样性分析
• 4 讨论
• 第五章 仿刺参性别差异的初步研究
• 第一节 仿刺参性别差异的组织学分析
• 1 材料
• 1.1 样本来源
• 1.2 试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 固定
• 2.2 脱水
• 2.3 透明
• 2.4 浸蜡
• 2.5 包埋
• 2.6 切片
• 2.7 展片
• 2.8 烤片
• 2.9 HE 染色
• 2.10 封片
• 3 实验结果
• 3.1 刺参体壁肌肉
• 3.2 雄参生殖孔
• 3.3 雌参生殖孔
• 4 讨论
• 第二节 仿刺参性别相关分子标记的筛选
• 1 材料
• 1.1 样本来源
• 1.2 所用接头和引物
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 基因组DNA 提取
• 2.2 基因组DNA 的酶切
• 2.3 酶切产物与接头的连接
• 2.4 预扩增反应
• 2.5 选择性扩增反应
• 2.6 PAGE 电泳
• 2.7 AFLP 数据统计与分析
• 3 结果
• 3.1 雌雄仿刺参基因组DNA 提取结果
• 3.2 仿刺参基因组DNA 酶切结果
• 3.3 预扩增结果
• 3.4 选择性扩增结果
• 3.5 AFLP 结果多态性分析及银染结果
• 3.6 雌雄个体差异
• 4. 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢