猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及抗体ELISA方法的建立

论文摘要

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的主要病原,也被证明与猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍等多种猪圆环病毒病相关。PCV2的ORF2基因编码的Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,具有良好的免疫原性,是机体抵抗PCV2感染的主要免疫原。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了两株能表达PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒。首先克隆了ORF2△41基因,即缺失ORF2编码蛋白前41个氨基酸的核定位序列的ORF2基因、蜂毒肽基因（MEL基因）以及六聚组氨酸标签基因（6H基因）,并引入合适的酶切位点,将其插入FastBacTM1转移载体,获得了两个重组载体质粒,一个为插入了两个串联的ORF2基因载体质粒,命名为FBDORF2。另一个为插入了单独的ORF2基因的载体质粒,命名为FBSORF2。然后将两个重组质粒分别转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,同源重组后使目的片段转移到重组杆粒DNA（Bacmid DNA）上。再分别以脂质体转染法将重组杆粒DNA转染到sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,分别命名为DORF2和SORF2。经PCR和测序鉴定,成功获得了两株重组杆状病毒。病毒滴度测得DORF2毒的TCID50为10-6.33/mL;SORF2毒的TCID50为10-6/mL。将两株重组杆状病毒接种sf9细胞,72小时后进行PCV2和六聚组氨酸标签的荧光抗体染色,结果显示,两株重组杆状病毒的均能见明显的阳性细胞,说明所构建的杆状病毒在昆虫细胞中成功表达。以两株重组杆状病毒分别感染悬浮培养的TriEx sf9细胞,培养72小时后收集细胞上清液,上清液经过滤后使用镍柱进行亲和层析纯化Cap蛋白。经SDS-PAGE鉴定,两株病毒的表达产物分别在约51KDa处和28KDa处有较单一且明显的条带,与预期大小基本一致,且DORF2毒株的表达量高于SORF2;Western-blot印迹表明,两个病毒表达的Cap蛋白均能与PCV2阳性血清发生特异反应。以纯化的Cap蛋白为基础,初步建立了检测PCV2抗体的间接ELISA检测方法。确定了ELISA反应的几个最佳反应条件:Cap蛋白的最佳包被浓度为0.31μg/mL;待检血清最佳稀释度为100倍稀释;最适酶标二抗的工作浓度为20000倍稀释;最适包被条件为4℃16小时;最佳封闭液为10%脱脂奶粉的PBS溶液;特异性试验证明,该方法与PRV、PPV、CSFV、PRRSV、猪丹毒、仔猪副伤寒、副猪嗜血杆菌等猪常见疾病的抗体均无交叉反应;以初步建立的ELISA方法检测采自河北保定农村散养猪的血清样本,其结果显示,田间样本的PCV2抗体阳性率为61.5%,与INGEZIM公司PCV2抗体检测试剂盒的检测结果符合率为94.8%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 猪圆环病毒研究进展
• 1.1.1 猪圆环病毒的发现与分类地位
• 1.1.2 猪圆环病毒的基本结构和特性
• 1.1.3 基因组结构及主要蛋白的功能
• 1.1.4 PCV2的致病机制
• 1.1.5 PCV2引起的相关疾病
• 1.1.6 PCV2的诊断方法
• 1.2 杆状病毒表达系统
• 1.2.1 大肠杆菌-昆虫细胞穿梭质粒载体系统（Bac to Bac系统）简介
• 1.2.2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的操作流程
• 1.2.3 杆状病毒表达系统的优点
• 1.2.4 杆状病毒表达系统的应用
• 1.2.5 杆状病毒表达载体的不足和展望
• 第二章 本研究目的、意义及研究内容和技术路线
• 2.1 研究目的和研究意义
• 2.2 研究内容和技术路线
• 第三章 重组杆状病毒的构建
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 全长ORF2基因的克隆
• 3.2.2 用于构建载体的单个基因的扩增与克隆
• 3.2.3 转移载体的构建
• 3.2.4 杆状病毒的构建
• 3.2.5 重组杆状病毒滴度测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 全长ORF2基因的PCR扩增
• 3.3.2 用于构建载体的单个基因的扩增结果
• 3.3.3 转移载体的鉴定
• 3.3.4 重组杆状病毒的鉴定
• 3.3.5 重组杆状病毒滴度测定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于体外基因表达系统
• 3.4.2 关于杆状病毒表达系统的改进
• 3.4.3 关于杆状病毒表达系统适用的细胞系
• 3.5 小结
• 第四章 CAP蛋白的表达、鉴定及纯化
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 蛋白的表达
• 4.2.2 蛋白鉴定
• 4.2.3 蛋白纯化
• 4.3 结果
• 4.3.1 PCV2直接荧光抗体染色结果
• 4.3.2 His标签的间接免疫荧光
• 4.3.3 SDS-PAGE电泳
• 4.3.4 Western Blot
• 4.3.5 蛋白纯化
• 4.4 讨论
• 4.4.1 关于蛋白鉴定
• 4.4.2 关于蛋白纯化
• 4.5 小结
• 第五章 间接ELISA检测方法的建立
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
• 5.2.2 酶标二抗浓度的确定
• 5.2.3 包被条件的摸索
• 5.2.4 封闭液的选择
• 5.2.5 阴阳性临界值判断标准
• 5.2.6 特异性试验
• 5.2.7 田间样本检测
• 5.3 结果
• 5.3.1 抗原包被浓度确定
• 5.3.2 血清稀释倍数的确定
• 5.3.3 二抗浓度的确定
• 5.3.4 包被条件的摸索
• 5.3.5 封闭液的选择
• 5.3.6 临界值确定
• 5.3.7 特异性试验
• 5.3.8 田间样本检测结果
• 5.4 讨论
• 5.4.1 关于PCV2的检测方法的比较
• 5.4.2 关于建立PCV2的ELISA检测方法
• 5.5 小结
• 第六章 结论与创新
• 6.1 结论
• 6.2 创新
• 第七章 下一步工作设想
• 7.1 进一步摸索ELISA反应其他条件
• 7.2 动物实验
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介