论文摘要
近年来,由于基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面的潜在应用前景而备受关注。基因治疗的主要过程是目的基因的获取和高效的基因转染。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因转染体系。基因转染常用的载体有病毒型载体和非病毒型载体。病毒型载体在当前批准进入临床试验的基因治疗中占60%以上,但病毒蛋白有诱发机体产生免疫反应、体内潜在的致癌致畸性、生产成本高、不能反复应用、转载能力有限等缺点,因此该类载体的应用也在一定程度上受到限制。相反,非病毒型载体制备简单、无免疫原性和比较安全,但是转染效率低是其致命缺点,尤其是在血清蛋白存在的情况下。所以寻找一种既高效又安全的基因载体是基因治疗领域面临的最紧要问题。当前,纳米载体以其转染效率较高、安全低毒、无免疫原性的特点引起越来越多的关注,在该领域,固体脂质纳米粒作为纳米基因载体中的“新秀”也吸引了不少研究者的目光。相对于其他纳米载体,固体脂质纳米粒具有许多明显的优势,这其中包括良好的储存稳定性,相对简单的制备过程,可以热压灭菌和冷冻干燥,可以大规模制备等。另外,固体脂质纳米粒主要由生理相容性的材料制备而成,因此该类载体在静脉注射时毒性较小。本文以硬脂酸（或ATO888）和卵磷脂为脂质材料,以增强型绿色荧光蛋白基因（pEGFP）作为报告基因,采用不同的工艺和组装技术制备出三种不同的载基因固体脂质纳米粒。其一是:阳离子固体脂质纳米粒/pDNA二元复合物;其二是:阴离子型载鱼精蛋白-pDNA复合物固体脂质纳米粒;其三是:阴离子型载pDNA固体脂质三元复合纳米粒。课题主要研究方法与结果如下:1.模型基因的选择和制备本研究中我们利用微生物发酵的方法大量培养转化有质粒的大肠杆菌,并采用柱层析的方法分离纯化质粒。紫外分光光度法对质粒的纯度和含量进行了测定,凝胶电泳法对质粒的单酶切结果进行了鉴定,结果显示质粒纯度符合要求。2.阳离子固体脂质纳米粒/pDNA二元复合物的研究本研究中我们制备阳离子固体脂质纳米粒替代传统的阳离子脂质体,以克服后者稳定性不佳的问题。文中以CTAB为表面活性剂采用复乳法制备空白阳离子固体脂质纳米粒,与报告基因复合,加入不同浓度Ca2+调节体系的荷正电量。最终得到的SLNs-pDNA二元复合物的平均粒径为（91.6±5.3）nm,粒径分布均匀,细胞平均存活率相对于阴性对照组均在80%到110%之间,在生理酶浓度条件下,载体具有较好的保护pDNA抗核酸酶降解的能力。体外释放实验结果显示,SLNs-pDNA二元复合物释药符合Weibull模型:lnln[1/（100-R/100）]=-0.4482lnt+0.1329,r=0.9926。据此可以预计,DNA在阳离子固体脂质纳米粒的保护下,能够维持较长的作用时间。体外转染实验结果表明,与裸露DNA相比,SLNs-pDNA在COS-7中的转染效果显著提高。在24h时复合物的转染能力较阳离子脂质体Lipofectamine低,到48h时细胞中的绿色荧光强度明显增强,蛋白表达率显著提高较Lipofectamine组有所加强。3.阴离子型载鱼精蛋白-pDNA复合物固体脂质纳米粒的研究鉴于阳离子型基因载体存在血液循环中稳定性差及给药途径单一等不足之处,我们考虑制备适合全身给药的阴离子型固体脂质纳米粒。文中采用阳离子聚合物—鱼精蛋白缩合pDNA形成致密复合物,提高裸pDNA的稳定性,进而将该复合物利用脂质材料进行包裹。其体外抗剪切实验,抗酶解实验和释放实验结果都能够与实验设计的初衷相吻合。本文中对阴离子型固体脂质纳米粒作为基因载体的研究是一个全新的尝试,在制备包封型固体脂质纳米粒时发现,最终产品的粒径较大,包封率为（86.5±5.28）%,粒径为（627±22.9）nm;控制粒径则不能够得到理想的包封率,粒径为（231±13.7）nm时,包封率仅为（41.5±3.62）%,从而不能达到进行细胞转染实验的要求,为此我们试图通过静电吸附的方法组装新型的载基因纳米粒,从而弥补包封型固体脂质纳米粒的不足。4.阴离子型载pDNA固体脂质三元复合纳米粒的研究在包封型载pDNA固体脂质纳米粒的研究结果不尽如人意的同时,本文采用固体脂质三元复合纳米粒的全新思路对阴离子型载基因固体脂质纳米粒的研究予以补充和完善。采用薄膜分散-超声法制备出平均粒径为（19.2±5.5）nm的阴离子型空白固体脂质纳米粒,在静电作用下将其自组装到平均粒径为（165±28.1）nm的正电性鱼精蛋白-pDNA二元复合物表面,最终形成平均粒径为（257.7±10.6）nm,zeta电位为（-17.16±1.92）mV的三元复合纳米粒,其结合率达到（96.75±1.13）%。TEM和CD实验结果均验证了三元复合纳米粒的形成。体外抗酶解实验结果显示,二元复合物和三元复合纳米粒中完整DNA的回收率分别为60%和85%,降解率具有显著性差异（p＜0.05）。体外释放实验在PBS中进行,三元复合纳米粒的释放过程符合Ritger-Peppas方程:lnR=0.6038 ln t+1.5292（r=0.9942）,有明显的体外缓释能力。与二元复合物相比,48h内三元复合纳米粒的细胞成活率较前者高（P＜0.05）,并且明显低于阳性对照（Lipofectamine组）的细胞毒性。体外基因转染结果显示,48h的转染量接近Lipofectamine组,高于二元复合物组。综上所述,固体脂质纳米粒对pDNA保护作用强,所载DNA能够从载体中缓慢释放,细胞耐受性良好,体外转染效率较高,是具有一定开发前景的非病毒纳米基因载体。
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