论文摘要
肺癌是严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤[1]。据世界卫生组织报告，因肺癌死亡的患者占恶性肿瘤死亡的19%，到2025年我国每年肺癌患者将超过100万，成为世界第一肺癌大国。肺癌目前主要采取以手术切除后进行放化疗的综合治疗，但效果并不理想。究其原因，一方面是由于肺癌的发病率和转移率较高，肺癌患者的5年生存率不足15%。导致大部分患者死亡的因素不是因为肿瘤复发，而是发生了远处转移。在某些早期肺癌（T1N0M0）中，一经诊断就发现已经发生远处转移，或者存在亚临床转移。对此，现代医学没有特别有效的治疗方法。另一方面，在包括肺癌在内的各种恶性肿瘤中发现存在一群数量微小、具有自我更新和多向分化的潜能的特殊细胞亚群——肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）[2]。该群细胞的侵袭能力、成瘤能力均较普通肿瘤细胞强[3]，且可耐受放化疗[4]，从而导致常规的治疗策略失效。已有大量的实验证实，肿瘤干细胞在肿瘤从发生到演进，直至预后的一系列进程如：肿瘤发生、血管生成[5]、免疫抑制[6]、侵袭转移及复发中扮演着重要作用。深入研究肿瘤干细胞的生物学特性，对于解释肿瘤形成过程中患者的临床表现及阐明其发生的机制具有重要意义，并为下一步新的靶向治疗提供依据。对肿瘤干细胞进行深入研究，首先要做的就是正确识别肿瘤干细胞。现阶段判断某群细胞是否是肿瘤干细胞的标准为表达干细胞标记、具有自我更新和多向分化潜能以及在动物体内连续的成瘤能力。其中争议最大的是干细胞标记，因为肿瘤类型的不同而有所差异[1][2]。尽管如此，维持胚胎干细胞自我更新和多能性的转录因子POU5F1和Sox2等作为肿瘤干细胞标记已经被大家广泛接受[3][4][5]。起初关于POU5F1和Sox2转录因子的研究主要集中在胚胎干细胞中，后来逐渐扩展到肿瘤研究中[6]。自从提出肿瘤干细胞的概念之后，POU5F1在肿瘤干细胞生物学中发挥的作用也就顺理成章的成了研究人员关注的焦点[7]。为了研究POU转录因子家族成员POU5F1在肿瘤侵袭转移中的作用机制，我们以肺癌作为研究模型，首先从A549细胞中分离并鉴定了肺癌肿瘤干细胞样细胞（Lung Adenocarcinoma Cancer Stem-like Cells，LACSLCs），并比较了LACSLCs与普通肿瘤细胞的迁移和侵袭能力；其次，我们用慢病毒干扰的方法下调LACSLCs中POU5F1的表达，观察其对细胞迁移和侵袭能力的影响；然后，我们检测POU5F1表达下调之后，观察经典的肿瘤侵袭转移相关蛋白基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinases2，MMP2）的表达变化，以及二者之间的调控关系；最后，我们研究了POU5F1、MMP2与预后之间的关系，揭示其可作为预测患者预后的生物标志。肿瘤细胞主要通过血管或淋巴道发生转移。其要发生转移，很关键的一步就是肿瘤细胞在转移过程中避免被机体免疫系统识别和杀伤。大量研究发现，肿瘤细胞逃避免疫系统监视的机制分为两方面：1、肿瘤细胞自身的免疫逃逸机制，如细胞表面“抗原覆盖”或被封闭[8]、抗原和免疫应答分子表达下调或缺失[9]、表达抑制性共刺激分子[10]以及细胞死亡信号通路缺陷等；2、抑制免疫系统功能，如减少免疫细胞浸润、抑制免疫细胞功能[11]、诱导免疫细胞凋亡以及诱导调节T细胞（regulatory T cell，Treg）等。而肿瘤干细胞免疫学方面的研究，还在起步阶段。树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）作为具有最强抗原提呈能力的专职抗原提呈细胞，与肿瘤干细胞相互作用的研究还未见报道。因此，我们的另一部分研究选用成人最常见的原发性中枢神经系统肿瘤——恶性胶质瘤作为研究模型，分别从小鼠胶质瘤细胞系GL261、人胶质瘤细胞系U87和人胶质瘤原代细胞中分离和鉴定胶质瘤干细胞（Glioma stem cells，GSCs）；其次，培养小鼠树突状细胞系DC2.4并分离人树突状细胞，并进行鉴定；第三，分别使用GSCs/和贴壁生长肿瘤细胞（Adhered cells，ACs）上清液诱导DCs分化，观察前者对后者分化的影响；最后，我们研究了GSCs/ACs抑制DCs分化的可能机制。研究内容和主要研究结果：1.成球生长A549细胞具有更强的迁移和侵袭能力。半量换液成球培养得到的肿瘤细胞球可作为LACSLCs进行后续的实验：与普通细胞相比，成球生长的A549细胞高表达干细胞相关转录因子CD133、ALDH1、Sox2、POU5F1以及低表达分化标志物CK8和CK18；成球细胞可以在无血清培养基中连续成球；成球细胞相比贴壁细胞具有更强的成瘤能力。仅1×104个成球细胞即可在对应的动物模型中成瘤，然而贴壁细胞需要5×105个才能成瘤。不论是在平板划痕实验还是在铺有Matrigel的Transwell小室实验中，都证实成球细胞具有更强的迁移和侵袭能力，并且成球细胞形成的小鼠皮下移植瘤中可见到明显的侵袭性生长。2.高表达转录因子POU5F1的LACSLCs同样高表达MMP2。通过激光共聚焦和Western blotting的方法证实，在高表达POU5F1的LACSLCs中，同样高表达与肿瘤侵袭转移密切相关的MMP2。3. POU5F1直接调控MMP2的转录。（1）应用shRNA干扰技术，下调POU5F1的表达；（2）下调POU5F1表达后，LACSLCs平板迁移能力和Transwell侵袭能力均明显减弱（p<0.01）；（3）干扰POU5F1表达后，成球细胞的成瘤能力显著下降；（4）干扰POU5F1表达后，MMP2的表达随之下降；（5）通过免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证实POU5F1可直接结合MMP2的启动子区域，干扰POU5F1表达后，包含有MMP2启动子的荧光素酶报告系统的活性明显下降。4. POU5F1和MMP2可以作为评估肺癌预后的指标。在55例肺腺癌组织芯片标本中，高表达POU5F1和MMP2的病例数分别是26例（47.3%）和39例（70.9%），二者联合检测与患者的预后密切相关（P<0.01）。5.收集胶质瘤细胞的培养上清液，干预处于诱导分化阶段的树突状细胞，发现胶质瘤细胞（细胞系和原代培养细胞）可通过分泌细胞因子的方式抑制DC成熟；综上所述，本研究的主要结论是：1.人LACSLCs中POU5F1高表达与肺癌的侵袭转移密切相关，其通过直接调控MMP2增强肿瘤细胞迁移和侵袭的能力，导致肿瘤细胞生长和播散。2.对肺癌患者进行POU5F1和MMP2联合检测，可作为患者预后的依据。3.胶质瘤干细胞可能通过高表达免疫抑制性细胞因子VEGF-A和IL-10抑制DCs的成熟。
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相关论文文献
- [1].新疆维吾尔族和汉族子宫颈癌中POU5F1和NANOG在mRNA水平的表达及临床意义[J]. 癌症进展 2017(03)
- [2].肿瘤干细胞相关基因Bmi-1和POU5F1在子宫颈癌中的表达及临床意义[J]. 临床肿瘤学杂志 2017(07)
- [3].转录因子POU5F1在结直肠癌组织中的表达及临床意义[J]. 临床肿瘤学杂志 2016(08)
- [4].MiR-335通过作用于POU5F1负性调节骨肉瘤干细胞特性的实验研究[J]. 现代生物医学进展 2017(34)
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