心脏发育相关基因Foxp4相互作用蛋白的筛选与鉴定

论文摘要

本实验室前期利用酵母双杂交技术,筛选获得了与心脏发育基因Foxp4相互作用的15个候选蛋白,并分析了其中3个候选蛋白与Foxp4相互作用的情况。本文进一步分析其它12个候选蛋白是否与Foxp4相互作用,为研究Foxp4调控心脏发育的信号通路提供信息。本研究首先克隆12个与Foxp4相互作用的候选基因：Acta1、C17orf81、ABHD11、PTP4A3、RMBD5B、TNXB、HLA-DPB1、Loc100288161、COL1A1、COL3A1、COL4A2和FN1。从成人的肌肉和心脏组织中提取总RNA,反转录合成cDNA作为PCR扩增的模板。通过巢式PCR将扩增的目的片段克隆入pMD18T载体,经酶切检测与测序鉴定后,转入真核表达载体pCMV-Myc上。结果表明成功克隆了12个基因并构建出这12个基因的真核表达质粒。我们进一步将12个基因的pCMV-Myc质粒分别与pCMV-Tag2c-Foxp4质粒转染Hek293细胞后,进行免疫共沉淀实验。经抗Flag和Myc单抗两个方向检测Foxp4蛋白与12个蛋白之间的相互作用,证明12个候选对象中有3个候选蛋白Acta1、COL1A1和COL4A2与Foxp4有相互作用。我们同时制备了斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体,检测了Foxp4基因在斑马鱼早期胚胎和成体组织中的表达情况,发现Foxp4从1细胞期开始,随着胚胎发育的延续,其表达量逐渐增多,囊胚期开始下调,90%外包期又开始回升。Foxp4在成体组织中广泛表达,在脑、肌肉和鳃中表达较强,在心脏和眼中表达较弱。我们还进一步研究了其中一个候选基因Fbxl5在胚胎发育过程中的时空表达,并利用基因芯片分析敲低Fbxl5的表达时对其它基因表达的影响。通过搭桥PCR的方法克隆了斑马鱼Fbxl5基因,制备了该基因多克隆抗体。利用该抗体分析了斑马鱼早期胚胎和成体组织中的表达情况,发现Fbxl5在胚胎发育中一直较稳定表达,1细胞期表达较多,随着胚胎发育表达量略有下降,囊胚期开始又回升之后除24 h表达量较低外,其余时期均较稳定表达。斑马鱼成体中,Fbxl5在脑、心脏、肾、鳃、肌肉、肠中表达,其中鳃中表达最强,而在肌肉,肠中表达较弱。利用Fbxl5-MO敲低Fbxl5在斑马鱼胚胎中的表达,分析发育48 h和对照胚胎样品的mRNA含量差异,基因芯片分析结果表明,斑马鱼14295个基因中共检测到差异性表达的基因1874个,包括心脏标志基因tnc、vmhc、myl7等。总之,本文克隆出12个与Foxp4相互作用的候选基因,通过免疫共沉淀技术进一步证明其中3个基因Acta1、COL1A1和COL4A2与Foxp4相互作用,制备了斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体,分析了其在斑马鱼早期胚胎中和成体组织中的表达情况,为进一步探清Foxp4的分子机制奠定了基础。同时,对候选基因Fbxl5开展的一些工作为以后的研究提供了帮助。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言和文献综述
• 1.1 蛋白质相互作用的研究方法概述
• 1.2 Fox基因家族简介
• 1.3 FoxP基因简介
• 1.4 本文研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 酶类和试剂盒
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 缓冲液和培养基
• 2.1.4 其他试剂
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.1.6 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 2.2 方法
• 2.2.1 组织样品RNA抽提
• 2.2.2 RNA甲醛变性胶电泳
• 2.2.3 第一条cDNA链的合成
• 2.2.4 PCR反应混合液配制
• 2.2.5 PCR反应
• 2.2.6 PCR产物的纯化回收
• 2.2.7 连接
• 2.2.8 感受态细胞的制备
• 2.2.9 转化（热休克法）
• 2.2.10 质粒的小量制备
• 2.2.11 阳性克隆的筛选与鉴定
• 2.2.12 测序
• 2.2.13 细胞培养
• 2.2.14 细胞瞬时转染
• 2.2.15 蛋白的提取
• 2.2.16 免疫共沉淀
• 2.2.17 SDS-PAGE
• 2.2.18 Western blot
• 3 结果与讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 人组织total RNA的提取及cDNA的合成
• 3.1.2 Actal、C17orf81、ABHD11等12个基因的克隆与鉴定
• 3.1.2.1 Actal基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.2 C17orf81基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.3 PTP4A3基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.4 ABHD11基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.5 RMND5B基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.6 TNXB基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.7 HLA-DPB1基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.8 Loc100288161基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.9 COL1A1基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.10 COL3A1基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.11 COL4A2基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.2.12 FN1基因克隆入T载体及鉴定
• 3.1.3 ACTA1、C17orf81、ABHD11等12个基因真核表达质粒的构建
• 3.1.4 ACTA1、C17orf81、ABHD11等12个蛋白分别与Foxp4的CO-IP实验
• 3.2 讨论
• 4 其它工作
• 4.1 斑马鱼Foxp4基因相关工作
• 4.1.1 斑马鱼Foxp4基因兔多克隆抗体的制备
• 4.1.1.1 Z-Foxp4基因片段PCR扩增及重组质粒的构建
• 4.1.1.2 Z-Foxp4融合蛋白的诱导表达和纯化
• 4.1.1.3 Z-Foxp4兔多克隆抗体检测
• 4.1.2 Foxp4基因在斑马鱼早期胚胎与成体组织的表达
• 4.1.2.1 Foxp4基因在斑马鱼早期胚胎的表达
• 4.1.2.2 Foxp4基因在斑马鱼成体组织的表达
• 4.1.3 本节讨论
• 4.2 斑马鱼Fbxl5基因相关工作
• 4.2.1 搭桥PCR法克隆Z-Fbxl5基因CDS
• 4.2.2 斑马鱼Fbxl5基因兔多克隆抗体的制备
• 4.2.2.1 原核表达质粒pET28a-Z-Fbxl5的构建
• 4.2.2.2 Z-Fbxl5融合蛋白的诱导表达和纯化
• 4.2.2.3 Z-Fbxl5兔多克隆抗体检测
• 4.2.3 Fbxl5基因在斑马鱼胚胎与成体组织的表达
• 4.2.3.1 Fbxl5基因在斑马鱼胚胎中的表达
• 4.2.3.2 Fbxl5基因在斑马鱼成体组织的表达
• 4.2.4 基因芯片分析Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异
• 4.2.5 本节讨论
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 后记