二色补血草两个几丁质酶基因克隆及功能研究

论文摘要

几丁质酶是一种能降解几丁质及其衍生物的糖基水解酶,它能催化真菌细胞壁的重要成分—几丁质的水解,从而抑制真菌的生长增殖,提高植物的抗真菌能力。虽然植物中并不存在几丁质物质但几丁质酶却广泛存在于植物中。近年来,随着对其作用机理、生化性质、表达调控的深入研究,用几丁质酶基因转化植株正日益成为植物防御真菌病害的有效途径。本研究克隆了二色补血草两个几丁质酶基因chi31和chi32。cDNA的GenBank接受号分别为DQ431248和DQ431249;DNA的GenBank接受号分别为EU744178和EU744179。通过对病原真菌胁迫后二色补血草chi31和chi32的表达情况的定量研究表明,当用土传病害（尖孢镰刀菌）侵染根部时,在根部chi31大量表达,而chi32表达量很低;而在叶部两基因表达量基本一致。当用从二色补血草中分离出的真菌病原菌侵染二色补血草叶部时,chi32始终是上调表达,而chi31表现出上调下调表达交替出现。两个内切几丁质酶基因对真菌病害的侵入均有防御反应。在同一组织中,两基因在表达上存在时间上的先后;在不同组织中,同一基因的表达量也存在差距。这说明,这两个基因可能在二色补血草中起到不同的作用,或分别隶属于不同的生物学途径。利用分泌型表达载体pPIC9研究两个几丁质酶基因的功能,分别构建分泌型表达质粒pPIC9-chi31、pPIC9-chi32,并用电转化法转化至巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）。甲醇诱导培养毕赤酵母转化子,通过对发酵液蛋白的SDS-PAGE检测,得到了能够分泌重组蛋白的阳性毕赤酵母工程菌株。利用改良的Schales法对转化子发酵液的酶活力进行测定,证实了CHI31、CHI32在毕赤酵母GS115和KM71菌株中均能够直接分泌有生物活性的重组酶。并且对重组酶酶学特性进行了分析:重组CHI31最适酶促反应条件为Mn2+5mmol/L,温度40℃,pH值5.0。依照该体系以杨树烂皮病菌细胞壁为底物测得的重组CHI31发酵液粗酶活能达到0.88U。重组CHI32最适酶促最佳反应体系Ba2+5 mmol/L,温度45℃,pH值5.0。依照该体系以尖孢镰刀菌细胞壁为底物测得的重组CHI32发酵液粗酶活能达到1.09U。重组CHI31对于真菌细胞壁的酶活普遍较纯几丁质及其衍生物高。在最适条件下,以N.O-羧甲基几丁质为底物测得的重组CHI31发酵液粗酶活能达到0.56U,而以杨树烂皮病细胞壁为底物测得的重组CHI31发酵液粗酶活能达到0.88U。这个结果证明了重组CHI31具有降解病原真菌细胞壁的潜力,为重组CHI31在预防林木真菌病害提供了依据。而重组CHI32对于化合物的酶活普遍较真菌细胞壁高,在最适反应体系下,以尖孢镰刀菌细胞壁为底物测得的重组CHI32发酵液粗酶活能达到1.09U,而以N.O-羧甲基几丁质为底物测得的酶活能达到1.13U。说明两基因在植物体中的作用可能存在互补,推测可能是对外界侵入的真菌作用的时间存在先后顺序。本研究获得的重组酶的生产基因工程菌株可以用于林农业的防病抗病工程,而且利用巴斯德毕赤酵母生产重组酶,可以大大的降低生产成本,能够降低对病害防治的投入,降低林农业生产中的损失。同时本研究还为今后将几丁质酶基因转入植物体内提供了有力的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 二色补血草简介
• 1.2 植物病害研究现状
• 1.2.1 林木病虫害造成的经济损失和环境影响
• 1.2.2 植物病害防治研究动态
• 1.3 植物几丁质酶性质及在真菌病害防治中的应用
• 1.3.1 几丁质酶的分类
• 1.3.2 植物几丁质酶的生物学特性
• 1.3.3 几丁质酶在植物真菌病害生物防治中的应用
• 1.4 重组酶表达系统的选择与研究现状
• 1.5 本项研究的目的及意义
• 2 几丁质酶基因chi31及chi32的克隆及生物信息学分析
• 2.1 几丁质酶基因chi31的克隆及生物信息学分析
• 2.1.1 chi31基因的cDNA及DNA克隆
• 2.1.2 chi31基因的生物信息学分析
• 2.1.3 chi31基因的多序列比对
• 2.2 几丁质酶基因chi32的克隆及生物信息学分析
• 2.2.1 chi32基因的cDNA及DNA的克隆
• 2.2.2 chi32基因的生物信息学分析
• 2.2.3 chi32基因的多序列比对
• 2.3 几丁质酶chi31及chi32比较
• 2.4 本章小结
• 3 植物病原真菌胁迫下chi31及chi32的表达差异
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料及菌株
• 3.1.2 定量PCR引物
• 3.1.3 常用试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 尖孢镰刀菌胁迫下二色补血草几丁质酶基因的表达
• 3.2.2 叶部病害胁迫下二色补血草几丁质酶基因的表达
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 二色补血草总RNA的提取和纯化
• 3.3.2 反转录后的PCR检测
• 3.3.3 尖孢镰刀菌胁迫下二色补血草根部和叶部cDNA荧光定量PCR结果
• 3.3.4 叶部病害胁迫后两基因在叶部的表达情况
• 3.4 讨论
• 3.4.1 二色补血草RNA提取方法的讨论
• 3.4.2 叶部病害分离、鉴定的讨论
• 3.4.3 几丁质酶基因与抗真菌病害的相关性
• 3.5 本章小结
• 4 几丁质酶基因chi31和chi32在毕赤酵母中的表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株与载体
• 4.1.2 酶和引物
• 4.1.3 酶活测定试剂
• 4.1.4 SDS-PAGE试剂
• 4.1.5 培养基
• 4.1.6 常用试剂
• 4.1.7 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 胞外表达质粒pPIC9-chi31,pPIC9-chi32的构建及其鉴定
• 4.2.2 几丁质酶基因chi31,chi32转化整合酵母细胞
• 4.2.3 酵母转化子细胞的培养与诱导
• 4.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳分析
• 4.2.5 重组几丁质酶的部分酶学特性的研究
• 4.2.6 重组酶粗酶液抗病原真菌的初步研究
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 载体与目的基因的双酶切
• 4.3.2 大肠杆菌重组质粒的PCR筛选和双酶切鉴定
• 4.3.3 几丁质酶基因转化整合酵母细胞
• 4.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳分析
• 4.3.5 重组几丁质酶的部分酶学特性的研究
• 4.3.6 重组几丁质酶对不同真菌细胞壁的水解作用
• 4.4 讨论
• 4.4.1 重组载体转化毕赤酵母方法的选择和条件的优化
• 4.4.2 筛选GS115转化子两种Mut表型
• 4.4.3 重组转化子的筛选原则
• 4.4.4 摇瓶培养毕赤酵母原则
• 4.4.5 表达的二色补血草几丁质酶大小探讨
• 4.4.6 关于几丁质酶的活力测定的方法选择及原则
• 4.4.7 提高重组几丁质酶抗病原能力的讨论
• 4.4.8 重组蛋白CHI31、CHI32的生物活性比较的讨论
• 4.4.9 重组蛋白CHI31、CHI32降解卵菌细胞壁的讨论
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢