论文摘要
本文首先根据Genbank所发布的烟曲霉菌壳聚糖酶基因序列人工合成8条DNA长链及4条引物链。利用PCR拼接法扩增壳聚糖酶基因并克隆入pGEM?-T easy载体,进行序列分析后,进一步亚克隆入pGEX-3X和pTracerTM-CMV/Bsd载体,分别构建原核表达载体pGEX-3X-Csn和真核表达载体pTracer-Csn。 重组质粒pGEX-3X-Csn转化EcoliDH5α,IPTG诱导表达,亲和层析及Factor Xa纯化消化重组GST-Csn融合蛋白,得到重组Csn纯品。降解壳聚糖活性实验表明,所得重组壳聚糖酶具有降解壳聚糖的生物活性。 之后,我们以C2C12小鼠成肌细胞为宿主细胞,分别以脂质体和壳聚糖为载体,介导pTracer-Csn质粒与含β-半乳糖苷酶报告基因的质粒pTracer-LacZ共同转染,通过测定β-半乳糖苷酶的瞬时表达量来反映壳聚糖的转染效率。结果证实,将可特异性降解壳聚糖的重组壳聚糖酶的基因转染宿主细胞,降解壳聚糖-DNA复合物中的壳聚糖载体,增加外源DNA在宿丰细胞内的释放量,不但可显著地提高壳聚糖的表观转染效率,更提高外源基因在转染细胞中的表达效率。作为基因的递送载体,壳聚糖具有极大的研究及开发价值。
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