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棉花Cu/Zn-SOD基因的克隆与表达的初步研究

2020-11-23阅读(214)

棉花Cu/Zn-SOD基因的克隆与表达的初步研究

论文摘要

短季棉的早熟早衰问题严重影响棉花的产量和品质;目前短季棉早熟早衰问题,在生理生化水平已经作了比较详细的研究,已有的结果显示:早熟不早衰品种和早熟早衰品种相比,它们的抗氧化酶活性后期表现高、稳定,主要起作用的关键酶是SOD,因此,进一步从分子水平揭示早熟早衰的分子机制,克隆相关基因并进行有关研究是非常必要的,对于提高短季棉产量、品质具有重要的意义。 （1）以短季棉早熟不早衰品种中棉所36真叶为材料,对其进行伤诱导和高温处理,然后提取总RNA,得到cDNA,以处理叶片的cDNA为模板,利用RACE技术,克隆了在棉花SOD酶活中占比例最大的Cu/Zn SOD基因（约占86%）,该基因包括两个:叶绿体Cu/Zn SOD基因和胞质Cu/Zn SOD基因。其中叶绿体Cu/Zn SOD基因的注册号为DQ120514,基因序列长度1043bp,包含一个645bp的开放阅读框,起始于98位终止于745位,编码215个氨基酸。在棉花基因中是两个拷贝,棉花叶绿体Cu/Zn SOD蛋白与其它植物的叶绿体Cu/Zn SOD蛋白的氨基酸同源性为65.7%～81%。棉花叶绿体Cu/Zn SOD蛋白质的分子量为25.0KD,等电点为6.11。该蛋白质具有两个酶活性中心,位于叶绿体的基质中,是个球蛋白。胞质Cu/Zn SOD基因的注册号为DQ445093,基因序列长度682bp,包含一个456bp的开放阅读框,起始于120位终止于578位,编码152个氨基酸。在棉花基因中是一个拷贝,棉花胞质Cu/Zn SOD蛋白与其它植物的胞质Cu/ZnSOD蛋白的氨基酸同源性为81%～87%。棉花叶绿体Cu/Zn SOD蛋白质的分子量为15.03KD,等电点为6.09。该蛋白质具有两个酶活性中心,位于细胞质中,是个球蛋白。 （2）基因表达分析表明:叶绿体Cu/Zn SOD基因在幼嫩的茎、花中有微量的表达,在叶片中高效表达;在中棉所36的苗期、始花期、盛花期、铃期和吐絮期分别采真叶提取RNA检测叶绿体Cu/Zn SOD基因的表达结果显示:基因在苗期表达较低,到初花期到达最高,然后表达量下降。 胞质Cu/Zn SOD基因表达活性在根中最高,其次为叶片,下胚轴,花和茎的表达较弱。说明胞质Cu/Zn SOD基因主要在根和叶片中表达;在整个棉花生育期中呈现有规律的动态变化,从苗期开始基因表达逐渐增强,到盛花期达到顶峰,以后逐渐下降;但是从整个生育期观察,后期的活性比前期高。 （3）棉花叶绿体Cu/Zn SOD基因的原核表达检测:在基因的起始密码子和终止子处设计一对引物,以cDNA为模板扩增得到完整的基因全长,然后,构建中间重组子pUC-1-SOD;再构建原核表达载体pET-Cu/Zn-SOD,IPTG诱导表达结果显示转化菌株比对照组SOD酶活增高17%,显示表达产物具有SOD酶的活性。 （4）棉花叶绿体Cu/Zn SOD基因的植物转化载体的构建:在基因的起始密码子和终止子处设计一对引物,以cDNA为模板扩增得到完整的基因全长,构建中间重组子pUC-2-SOD,然后,再构建植物转化载体pBIY-SOD,双酶切及PCR检测均证实载体构建正确。

论文目录

  • 第一章 文献综述
  • 1.1 与棉花早熟性及早熟不早衰相关的研究概况
  • 1.1.1 早熟性的标记指标方面
  • 1.1.2 棉花早熟性的生理测定指标
  • 1.1.3 早熟棉早熟性构成因素的遗传规律的研究
  • 1.1.4 棉花早熟不早衰生理生化机制的研究
  • 1.1.5 有关早熟性的基因控制方面的研究
  • 1.2 国内外目前棉花基因克隆的研究进展
  • 1.2.1 国内棉花基因克隆的研究进展
  • 1.2.2 国外棉花基因克隆的研究进展
  • 1.3 国内外植物超氧化物歧化酶的研究进展
  • 1.3.1 超氧化物歧化酶的基本研究
  • 1.3.2 超氧化物歧化酶的基因克隆与转基因方面的研究
  • 1.4 目前常用的基因克隆的技术方法
  • 1.4.1 基因芯片技术分离目的基因
  • 1.4.2 基因文库技术分离目的基因
  • 1.4.3 功能蛋白组分离目的基因
  • 1.4.4 PCR技术在基因克隆中的应用
  • 1.4.5 mRNA差别显示技术分离差别表达基因
  • 1.4.6 插入突变分离克隆目的基因
  • 1.4.7 图位克隆目的基因
  • 1.4.8 酵母双杂交系统分离克隆基因
  • 1.4.9 生物信息学在分离克隆基因中的应用
  • 1.4.10 基于 RACE技术获得cDNA全长
  • 1.4.11 基因分离克隆的新技术
  • 1.5 目前国内外克隆其它植物超氧化物歧化酶基因的常用方法
  • 1.6 本研究的目的意义
  • 第二章 棉花超氧化物歧化酶基因的克隆和表达分析
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 植物材料
  • 2.1.2 菌株和质粒
  • 2.1.3 酶和生化试剂
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 RNA的提取及质量检测
  • 2.2.2 反转录
  • 2.2.3 棉花 Cu/Zn-SOD基因的分离
  • 2.2.4 棉花 Cu/Zn-SOD基因的Southern blotting分析
  • 2.2.5 基因的表达分析
  • 2.2.6 棉花 Cu/Zn-SOD基因的生物信息学分析
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 棉花 RNA提取分析
  • 2.3.2 棉花 Cu/Zn-SOD基因的克隆和序列分析
  • 2.3.3 棉花叶绿体 Cu/ Zn-SOD基因的生物信息学分析
  • 2.3.4 棉花 Cu/Zn SOD的Southern blotting分析
  • 2.3.5 棉花 Cu/Zn-SOD酶蛋白表达分析
  • 2.3.6 棉花胞质 Cu/ Zn-SOD酶蛋白的生物信息学分析
  • 2.3.7 棉花叶绿体Cu/Zn SOD和胞质 Cu/Zn SOD的同源性比较
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 Cu/Zn SOD基因的克隆和分析
  • 2.4.2 Cu/Zn SOD酶蛋白与植物的活性氧自由基清除
  • 2.4.3 棉花叶绿体与胞质Cu/Zn SOD酶蛋白的进化关系
  • 2.4.4 棉花叶绿体与胞质Cu/Zn SOD基因的表达与酶活变化
  • 第三章 棉花 Cu/ Zn-SOD基因原核表达载体的构建及表达检测
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 方法
  • 3.2 实验步骤
  • 3.2.1 Cu/Zn-SOD基因表达载体的构建
  • 3.2.2 表达载体和目标基因的连接
  • 3.2.3 SOD基因表达蛋白的电泳检测
  • 3.2.4 SOD酶活的测定
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 棉花叶绿体 Cu/Zn SOD原核表达载体构建分析
  • 3.3.2 棉花叶绿体 Cu/Zn SOD原核表达载体诱导表达分析
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 棉花叶绿体 Cu/Zn SOD原核表达载体构建
  • 3.4.2 棉花叶绿体 Cu/zn SOD原核表达载体诱导表达
  • 第四章 棉花铜锌超氧化物歧化酶基因的植物表达载体的构建
  • 4.1 材料
  • 4.2 方法
  • 4.2.1 植物表达载体pBI-YSOD载体的构建
  • 4.2.2 农杆菌 LBA4404的感受态细胞制备
  • 4.2.3 植物表达载体的构建及筛选
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 植物转化载体中间重组子的构建分析
  • 4.3.2 植物表达载体的构建及筛选分析
  • 4.4 讨论
  • 第五章 结论
  • 5.1 结论
  • 5.2 进一步工作的设想
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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