论文题目: 鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的表达纯化及药理活性研究
论文类型: 硕士论文
论文专业: 中药学
作者: 严守升
导师: 田育望,陈守春
关键词: 鲑鱼降钙素,内蛋白子,酰胺化,大肠杆菌,重组
文献来源: 湖南中医药大学
发表年度: 2005
论文摘要: 降钙素(calcitonin, CT)是一类重要的多肽类激素,在钙、磷代谢,骨骼的形成、分化和发育等多个环节有重要的作用,特别是鲑鱼降钙素(salmon calcitonin, sCT)在临床上有十分重要用途。sCT和许多多肽C末端的酰胺化对其生物学功能有重要的作用,但是这种酰胺化修饰在原核表达系统很难完成,表达的前体蛋白需要在细胞外经过酶的修饰才具有生物活性。为了用大肠杆菌制备有生物活性的sCT,在本研究中我们采用含有内蛋白子(Intein)的表达系统,在Intein剪切过程中,加入提供NH3的试剂达到酰胺化的目的。本文利用半化学半酶促法获得大肠杆菌密码子偏嗜的sCT基因,将sCT基因克隆入含有Intein的大肠杆菌融合型表达载体pTWIN 1中。重组表达载体转到大肠杆菌ER2566中,表达条件优化后,经发酵罐流加发酵,破菌,然后将表达的融合蛋白经CBD亲合柱纯化,并且在亲和柱上一步完成Intein介导的目的蛋白的剪切和C末端的酰胺化。获得的sCT进一步的分离纯化得到初级纯品,通过观察其对破骨细胞活动的抑制和大鼠降血钙试验来初步检测其生物活性。结果表明大肠杆菌重组的sCT融合蛋白经inein介导的剪切和酰胺化后,具有与化学合成的sCT相同的理化特征,并具有显著的降低大鼠血钙的活性,如果进一步优化工艺有望用于工业化生产。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
引言
第1部分 概述
1.1.国内外研究的现状
1.1.1.降钙素的结构与性质
1.1.2.降钙素的制备
1.1.3.降钙素的药理作用、作用机制及临床应用
1.2.本文主要内容和技术路线
第2部分 工程菌的构建
2.1.材料
2.2.方法
2.2.1.插入的DNA片断的制备
2.2.2.表达质粒pTWIN-1/sCT的构建
2.3.结果
2.3.1.插入DNA片段的制备
2.3.2.表达质粒pTWIN-1/sCT的构建
2.4.分析与讨论
第3部分 工程菌的发酵
3.1.材料
3.2.方法
3.2.1.摇瓶发酵的优化
3.2.2.菌体收获
3.2.3.破菌
3.2.4.目的蛋白的定量和鉴定分析
3.2.5.流加发酵
3.3.结果
3.3.1.摇瓶发酵的优化
3.3.2.Western Blotting分析
3.3.3.流加发酵
3.4.分析与讨论
第4部分 目的蛋白的纯化和鉴定
4.1.材料
4.2.方法
4.2.1.目的蛋白的剪切、修饰及纯化
4.2.2.目的蛋白的理化鉴定
4.3.结果
4.3.1.目的蛋白的纯化
4.3.2.目的蛋白的定性和纯度鉴定
4.3.3.目的蛋白的等电点测定
4.4.分析与讨论
第5部分 药理活性的初步检测
5.1.材料
5.2.方法
5.2.1.对大鼠破骨细胞活动的影响
5.2.2.大鼠血清钙降低法
5.3.结果
5.3.1.对大鼠破骨细胞的作用
5.3.2.对大鼠血清钙的影响
5.4.分析与讨论
结论
致谢
参考文献
发布时间: 2011-03-30
参考文献
- [1].酵母表达鲑鱼降钙素结肠定位缓释胶囊的制备及药动学研究[D]. 范鸣浩.青岛科技大学2011
相关论文
- [1].利用IMPACT-TWIN系统制备降钙素和胰岛素类似物的研究[D]. 何顺漪.东华大学2014
- [2].鲑鱼降钙素转基因定位整合的研究[D]. 兰翀.四川农业大学2011
- [3].重组鲑鱼降钙素生产工艺研究[D]. 付海云.沈阳药科大学2006
- [4].酵母表达鲑鱼降钙素结肠定位缓释胶囊的制备及药动学研究[D]. 范鸣浩.青岛科技大学2011
- [5].Thanatin的原核表达、纯化及其抗菌活性的检测[D]. 王沛珍.南方医科大学2010
- [6].五种黄酮类化合物与牛血清白蛋白相互作用及金属离子和酒精的影响研究[D]. 韩冬.河北医科大学2010
- [7].保胎灵治疗早期先兆流产的临床研究[D]. 陈勇.湖北中医药大学2010
- [8].公共环境项目绩效审计评价研究[D]. 张霞.重庆工商大学2010
- [9].内部环境审计人员专业能力问题研究[D]. 高姗.兰州商学院2010
- [10].鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽基因原核表达的研究[D]. 李洪丽.黑龙江大学2010