论文题目: 菲律宾蛤仔附着变态过程中的差异基因表达与基因克隆
论文类型: 博士论文
论文专业: 海洋生物学
作者: 卢素敏
导师: 包振民
关键词: 菲律宾蛤仔,附着变态,组蛋白,组蛋白
文献来源: 中国海洋大学
发表年度: 2005
论文摘要: 菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarumAdamsetReeve）又称蛤仔,广泛分布在我国黄、渤海海区,其肉味鲜美,营养丰富,为我国四大养殖贝类之一,是捕捞和人工养殖的对象。随着人们生活水平的日益提高,市场对该贝苗种的需求亦日益增加。附着变态过程是贝类生活史中的关健时期,是幼虫向成体转变的重要环节。蛤仔苗种的产量和质量在很大程度上取决于幼苗的附着变态过程,幼苗附着变态的成功与否往往决定着出苗量和育苗的成败。因此研究其受精生物学、胚胎发生、附着、变态等基础生物学的工作已引起科研工作者的重视,然而从分子水平方面阐明附着变态机理的研究还不太深入。本论文以菲律宾蛤仔附着变态时期的幼苗为实验材料,采用分子生物学技术,试图从分子水平上找出与菲律宾蛤仔附着变态及发育相关的基因,为贝类幼苗发育生物学,生理学及分子生物学的发展提供参考,同时为苗种业的开发提供一定的基础理论依据。主要结果如下: 1.采用DDRT-PCR技术,以受精后壳顶前期、壳顶期、眼点期、稚贝期的菲律宾蛤仔幼虫为实验对象,研究菲律宾蛤仔幼虫不同发育时期的基因表达,进而找出与菲律宾蛤仔附着变态相关的基因。 2.研究了肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸、KCl和CaCl2,在不同剂量和不同的诱导持续时间下,对菲律宾蛤仔眼点幼虫附着变态的诱导作用。在此基础之上,选取出最佳而又经济的神经递质类物质。肾上腺素(使用浓度为10-6M,诱导时间为4h),同样也采用DDRT-PCR技术,6组引物组合,扩增出343条带,67条具有明显表达差异,其中的18条在对照组中有高表达,而另外的49条差异带在实验组中有高表达,表明这些差异带所代表的基因都和。肾上腺素诱导有关,同时也从分子生物学水平上证明了肾上腺素参与了贝类附着变态机理的调控过程。 3.以菲律宾蛤仔眼点幼虫为实验材料,应用RACE技术,克隆了菲律宾蛤仔的replacement histone H3.3的全长cDNA序列（AY916800）:菲律宾蛤仔H3.3的基因组序列扩增结果表明:序列L[AY916802]大小为1214bp,含有一个长803bp的内含子;另一序列S[AY916803]长约411bp,不具有内含子。序列L和S编码和H3.3完全相同蛋白质序列,这表明菲律宾蛤仔的H3.3 cDNA
论文目录:
文献综述
一、贝类附着变态的研究意义
二、海洋贝类附着变态的诱导研究
1.金属离子对贝类附着变态的诱导作用
1.1 K~+离子对贝类附着变态的诱导作用
1.2 Ca~(2+)对贝类附着变态的诱导作用
1.3 Cr~(6+)离子及其它离子对贝类附着变态的诱导作用
2.自然诱导物对贝类附着变态的诱导作用
3.神经递质类物质对贝类附着变态的诱导作用
4.微生物对贝类附着变态的诱导作用
5.氨基酸类物质对贝类附着变态的诱导作用
三.影响贝类附着变态的其它因素
1.盐度，温度对贝类附着变态的诱导作用
2.附着基及其投放时间对贝类附着变态的诱导作用
四.贝类附着变态分子生物学水平方面的研究进展
1.海洋生物附着变态发育过程的细胞质调控机制
2.海洋生物附着变态发育过程的细胞核转录调控机制
第一章 菲律宾蛤仔幼体附着变态前后基因表达变化研究
0 引言
实验材料与试剂
实验方法
1.总RNA的提取：
2.RNA的纯化及检测
3.mRNA的逆转录(cDNA的合成)：
4.cDNA扩增：
5.PCR产物的聚丙烯酰胺电泳检测及显带
5.1 胶的制备
5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
5.3 银染显色
6.差异片段的回收及再扩增：
7.差异条带的克隆、测序及序列分析：
7.1 PCR产物的回收，连接及感受态的制备
7.1.1 使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物
7.1.2 回收产物和T载体的连接
7.1.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
7.1.4 质粒提取
7.2 质粒的酶切鉴定与序列分析
实验结果与分析
1.差异显示PCR结果：
2.差异条带的再扩增
3.PCR产物克隆、测序及序列比对分析结果
实验讨论
1.选取DDRT-PCR方法的可行性：
2.差异条带的再扩增
3.差异序列的分析，鉴定
第二章 化学物质诱导对菲律宾蛤仔附着变态和基因表达的影响
0 引言
实验材料与方法
1.化学物质诱导对菲律宾蛤仔附着变态的影响
1.1 幼苗培育
1.2 诱导物的配制及系列浓度设计
1.2.1 神经递质类药物
1.2.2 盐类物质
1.2.3 诱导剂处理持续时间设计
1.2.4 变态的标准检测
1.2.5 变态率的计算
2.化学物质诱导对菲律宾蛤仔附着变态时期基因表达的影响
2.1 神经递质类物质对菲律宾蛤仔附着变态时期基因表达的影响
2.2 无机盐类物质对菲律宾蛤仔附着变态时期基因表达的影响
实验结果
1.神经递质类物质对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
1.1 肾上腺素对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
1.2 去甲肾上腺素对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
1.3 多巴胺对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
1.4 GABA对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
2.无机盐类物质对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
2.1 KCl对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
2.2 CaCl_2对菲律宾蛤仔眼点幼虫变态的诱导效果
3.化学物质诱导对菲律宾蛤仔附着变态时期基因表达的影响
3.1 神经递质类物质(肾上腺素)诱导菲律宾蛤仔眼点幼虫后的差异显示PCR结果：
3.2 差异条带的再扩增
4.KCl诱导菲律宾蛤仔眼点幼虫后的差异显示PCR结果：
讨论
1.化学物质对菲律宾蛤仔眼点幼虫的诱导研究
1.1 神经递质类物质的诱导效果
1.2 无机盐类物质的诱导效果
2.化学物质(肾上腺素)对菲律宾蛤仔眼点幼虫基因表达的影响
第三章 菲律宾蛤仔DNA复制、转录相关的基因的克隆、序列分析与原核生物表达
0 前言
实验材料与方法
1.材料及试剂
1.1 克隆所需的材料及试剂
1.2 原位组织杂交所需材料及试剂
1.3 原核生物表达所需的载体、材料及试剂
1.3.1 载体及菌株：
1.3.2 试剂及仪器：
1.3.3 常用溶液及试剂的配制方法：
2.实验方法
2.1 5′RACE扩增replacement histone H3.3的全长cDNA序列
2.1.1 总RNA的提取
2.1.2 RNA的纯化及检测
2.1.3 cDNA第一链的合成
2.1.4 PCR扩增变异体H3.3基因的3′末端部分序列：
2.1.5 目的片段的纯化回收
2.1.6 回收产物连接、克隆与酶切鉴定
2.1.7 PCR产物的测序分析
2.1.8 5′-Race及其产物的克隆与测序
2.1.9 变异体H3.3基因的cDNA序列分析及同源性比较
2.2 从菲律宾蛤仔的基因组中扩增组蛋白H3及变异体H3.3基因的部分序列
2.2.1 基因组DNA的提取：
2.2.2 组蛋白H3及变异体H3.3基因的部分序列扩增
2.2.2.1 基因组扩增组蛋白H3：
2.2.2.2 基因组扩增H3.3：
2.2.3 扩增条带的回收、克隆、测序及序列分析
2.3 组织原位杂交检测菲律宾蛤仔H3.3基因的表达
2.3.1 石蜡切片的制备
2.3.2 杂交探针的制备
2.3.3 原位杂交及显色
2.4 pGEX-4T-H3.3原核表达载体的构建、表达及抗血清的制备
2.4.1 表达质粒pGEX-4T-H3.3的构建
2.4.1.1 引物设计
2.4.1.2 外源片段的扩增
2.4.1.3 PCR产物的克隆
2.4.1.4 PCR产物的测序分析
2.4.1.5 pGEX-4T-H3的构建方式(克隆载体和表达载体的酶切、连接及鉴定)：
2.4.2 融合表达质粒pGEX-4T-H3.3的诱导表达与SDS-PAGE检测：
2.4.2.1 表达条件的筛选与优化
2.4.2.2 SDS-PAGE电泳检测表达效果
2.4.2.3 IPTG的诱导表达
2.4.2.4 Western blot验证表达的目的条带
2.5 融合蛋白的纯化及抗血清的制备
2.5.1 融合蛋白纯化条件的摸索
2.5.1.1 使用Glutathione Sepharose 4B纯化融合蛋白
2.5.1.2 (NH_4)_2SO_4沉淀纯化抗原
2.5.1.3 Sephadex G-75柱子纯化
2.5.2 GST-H3.3融合蛋白抗原SDS-PAGE电泳、染色与切胶回收
实验结果与分析
1.5′RACE扩增变异体H3.3的全长cDNA序列
1.1 RNA的纯化结果
1.2 H3.33′末端的PCR扩增、克隆及序列分析
1.3 H3.35′末端的克隆与序列分析
1.4 菲律宾蛤仔H3.3基因的全长cDNA序列及其开放阅读框架分析
2.基因组扩增H3，H3.3基因的部分序列及序列分析：
2.1 H3.3及H3L-like的基因组扩增
2.2 H3的基因组扩增
2.3 菲律宾蛤仔H3，H3.3，H3L-like及ORF编码基因的比较结果：
2.4 菲律宾蛤仔组蛋白H3.3 ORF区的同源性分析
2.5 菲律宾蛤仔组蛋白H3的同源性分析
2.6 菲律宾蛤仔组蛋白H3L-like的同源性分析
3.Replacement组蛋白H3.3的原位组织杂交
3.1 探针的PCR扩增：
3.2 原位组织杂交结果：
3.2.1 H3.3在菲律宾蛤仔外套膜中的原位组织杂交结果
3.2.2 H3.3在菲律宾蛤仔鳃中的原位组织杂交结果
4 Replacement组蛋白H3.3的融合表达载体的构建和原核生物表达
4.1 表达质粒pGEX-4T-H3.3的构建
4.1.1 PCR扩增及序列鉴定结果
4.1.2.重组质粒的构建
4.1.2.1 pUC-H3.3质粒的酶切鉴定
4.1.2.2 pGEX-4T-3表达空载体的酶切鉴定：
4.1.2.3 重组质粒的构建：
4.2 IPTG的诱导表达及表达条件的筛选与优化：
4.2.1 融合蛋白在宿主菌BL21中的诱导表达
4.2.1.1 包函体中融合蛋白的表达情况
4.2.1.2 可溶性上清蛋白中融合蛋白的表达情况
4.2.2 融合蛋白在宿主菌DH5α中的诱导表达
4.2.2.1 包函体中融合蛋白的表达情况
4.2.2.2 上清液中融合蛋白的表达情况
4.2.3 融合蛋白在宿主菌JM109中的诱导表达
4.2.3.1 包函体中融合蛋白的表达情况
4.2.3.2 上清液中融合蛋白的表达情况
4.3 pGEX-4T-H3.3融合表达载体在DH5α中的扩培及诱导表达
4.4 融合蛋白GST-H3.3的表达及其鉴定结果
4.5 抗原纯化条件的摸索
4.5.1 Glutathione Sepharose 4B柱纯化融合蛋白
4.5.2 (NH_4)_2SO_4沉淀纯化抗原
4.5.3 Sephadex G-75柱子纯化
4.6 抗体制备
讨论
1.组蛋白H3及相关基因的克隆与序列分析
2.Replacement histone H3.3的组织原位杂交结果
3.融合蛋白GST-H3.3的表达及其鉴定结果
附：菲律宾蛤仔28S核糖体rDNA的染色体定位研究
0 前言
实验材料和方法：
1.实验材料及试剂：
2.染色体的制备：
3.探针来源：
4.FISH流程
4.1 染色体制片的准备
4.2 探针的制备：
4.2.1 PCR扩增FISH探针
4.2.2 探针变性
4.3 FISH杂交
4.3.1 标本变性及杂交
4.3.2 洗脱
4.3.3 封阻及复染
4.3.3 信号检测
实验结果
1.28S探针的PCR扩增结果：
2.FISH结果：
讨论
论文小结
参考文献
个人简历
致谢
发布时间: 2005-10-26
参考文献
- [1].菲律宾蛤仔养殖生物学、养殖技术与品种选育[D]. 闫喜武.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
- [2].菲律宾蛤仔体内寄生帕金虫的研究[D]. 梁玉波.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
- [3].三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）混养系统有机碳收支以及细菌生产力与代谢功能的研究[D]. 张凯.中国海洋大学2014
相关论文
- [1].栉孔扇贝生殖相关基因DEAD-box家族和boule的cDNA克隆及其发育表达图式[D]. 邵明瑜.中国海洋大学2007
- [2].双壳贝类幼虫变态诱导及其机理研究[D]. 张涛.中国科学院海洋研究所2000
- [3].鲍与扇贝遗传育种中的分子标记研究[D]. 万俊芬.中国海洋大学2003
- [4].菲律宾蛤仔养殖生物学、养殖技术与品种选育[D]. 闫喜武.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
- [5].菲律宾蛤仔体内寄生帕金虫的研究[D]. 梁玉波.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
- [6].高温胁迫和鳗弧菌感染对栉孔扇贝基因表达影响的分析及相关基因的克隆与表达[D]. 胡晓丽.中国海洋大学2005
- [7].调控文蛤幼虫变态的肾上腺素能受体类型及幼虫发育中神经和肌肉的变化[D]. 王国栋.中国科学院研究生院（海洋研究所）2006
- [8].中间球海胆与光棘球海胆的杂交及分子遗传学研究[D]. 周遵春.中国海洋大学2006
- [9].栉孔扇贝fosmid文库的构建及基因组结构特征分析[D]. 张玲玲.中国海洋大学2007
- [10].文蛤（Meretrix meretrix）幼虫生长发育相关基因的克隆和功能分析[D]. 王晓梅.中国科学院研究生院（海洋研究所）2008