牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究

论文摘要

体细胞核移植的成功说明了高度分化的细胞仍具有支持发育的全能性,卵母细胞胞质中存在着将分化体细胞重编程至多能胚胎细胞状态的全部因子。但是,体细胞核移植的成功率却非常低,而且克隆动物存在不同程度的发育缺陷。目前普遍认为,体细胞核移植的低成功率以及发育异常和供体细胞核的不完全表观遗传重编程有关。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显著的调控作用。本文对牛体外受精（IVF）胚胎和体细胞核移植（SCNT）胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行分析,找出体细胞克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异,研究表观遗传状态对克隆胚体外发育能力的影响。1.研究卵母细胞成熟培养液中添加表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对其体外发育的影响,精子的不同处理方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响以及细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30 ng/mL EGF可以显著提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率;精子经上浮法处理后可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞共培养可以显著提高受精后的囊胚发育率,可以用于牛IVF胚胎的体外培养。2.探讨了不同激活方法对牛核移植胚胎激活效果和体外发育的影响,以及细胞共培养体系对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,5μmol/L离子霉素联合2mmol/L 6-DMAP激活牛核移植胚胎的效果比较好,可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞饲养层共培养可以显著提高重构胚的囊胚发育率,比较适合作为体细胞核移植胚胎发育的共培养体系。3.采用免疫荧光染色技术,对牛IVF胚胎和SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行检测,研究克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异。结果表明,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显著高于IVF胚胎,从头甲基化时间提前;克隆胚胎4-细胞到囊胚阶段乙酰化水平低于体外受精胚胎,其中8-细胞阶段乙酰化水平显著低于体外受精胚胎。与体外受精胚胎相比,牛核移植胚胎附植前各阶段存在异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式。4.用DNA甲基化酶抑制剂（5-aza-dC）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-aza-dC（20nM,72h）处理供体细胞或者重构胚不能显著提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的表观遗传状态没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-aza-dC（20nM,72h）处理可以显著提高囊胚发育率和囊胚细胞数,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显著降低且与IVF胚胎相比差异不再显著,但组蛋白乙酰化水平没有明显改变。说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。5.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨组蛋白乙酰化变化与克隆胚胎体外发育的关系。结果表明,供体细胞经50nM TSA处理12h可以显著提高克隆胚胎的囊胚发育率,而且2-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平升高;TSA处理重构胚不能显著提高克隆胚胎的体外发育率,对重构胚的表观遗传状态没有显著影响;供体细胞和重构胚均用低浓度TSA（50nM,12h）处理可以显著提高克隆胚胎的囊胚发育率,8-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平显著增加且与IVF胚胎相比差异不再显著,但TSA处理对DNA甲基化水平没有明显影响。说明克隆胚胎组蛋白乙酰化水平影响其体外发育,增加2-细胞和8-细胞阶段组蛋白乙酰化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。6.联合应用5-aza-dC和TSA处理牛供体细胞和重构胚,研究两种试剂联合处理对重构胚发育的影响,以及对重构胚甲基化水平和乙酰化水平的影响。结果表明,5-aza-dC（20nM, 72h）联合TSA（50nM, 12h）处理供体细胞和重构胚可以更明显的提高克隆胚胎的体外发育能力,联合处理不但显著降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且显著增加了组蛋白的乙酰化水平,从而使克隆胚附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近与体外受精胚胎。说明异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式不利于克隆胚的体外发育,消除这种异常可以提高克隆胚的体外发育能力。进一步的实验表明,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 哺乳动物卵母细胞体外成熟与体外受精的研究进展
• 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟
• 1.1.1 卵母细胞成熟的机理
• 1.1.2 卵母细胞成熟的特征
• 1.1.3 卵母细胞成熟的判断
• 1.1.4 卵母细胞的获取与分级
• 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 1.2 精子的体外获能与体外受精
• 1.2.1 受精作用机制
• 1.2.2 精子体外获能
• 1.2.3 体外受精
• 1.2.4 体外受精的影响因素
• 1.3 受精卵的体外培养
• 1.3.1 受精卵体外发育阻断
• 1.3.2 受精卵体外培养系统
• 1.3.3 影响体外受精卵体外发育的因素
• 1.4 小结与展望
• 第二章 哺乳动物细胞核移植的研究进展
• 2.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展
• 2.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展
• 2.3 哺乳动物异种细胞核移植研究进展
• 2.4 哺乳动物细胞核移植的方法和程序
• 2.4.1 受体细胞的选择与去核
• 2.4.2 供体细胞的选择
• 2.4.3 细胞核的移植
• 2.4.4 重组胚的激活
• 2.4.5 重构胚的培养
• 2.5 哺乳动物核移植相关机理的研究进展
• 2.5.1 MPF 与核移植的关系
• 2.5.2 体细胞供体核的表观遗传重编程
• 2.6 影响哺乳动物核移植成功率的因素
• 2.6.1 核受体胞质对核移植的影响
• 2.6.2 核供体对核移植的影响
• 2.6.3 融合-激活方案对核移植的影响
• 2.6.4 核移植胚胎的体外培养对发育的影响
• 2.7 细胞核移植技术存在的问题和应用前景
• 2.7.1 细胞核移植技术存在的问题
• 2.7.2 细胞核移植技术的应用前景
• 第三章 牛卵泡卵母细胞体外受精的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 成熟液中添加EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响
• 3.2.2 不同精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响
• 3.2.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响
• 3.3.2 精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响
• 3.3.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响
• 3.4 小结
• 第四章 激活方法和共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响
• 4.2.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响
• 4.3.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响
• 4.4 小结
• 第五章 牛体细胞克隆胚胎DNA 甲基化和组蛋白乙酰化分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 抗5－甲基胞嘧啶抗体和抗组蛋白H3（acetyl K18）抗体特异性检测
• 5.2.2 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核DNA 甲基化水平比较
• 5.2.3 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核组蛋白乙酰化水平比较
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 DNA 甲基转移酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 5-aza-dC 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 6.2.2 5-aza-dC 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 6.2.3 体细胞和重构胚均用5-aza-dC处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 TSA 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 7.2.2 TSA 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 7.2.3 体细胞和重构胚均用TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第八章 5-aza-dC 联合 TSA 对牛核移植胚胎体外发育 及其表观遗传状态的影响
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 5-aza-dC＋TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响
• 8.2.2 不同个体来源成纤维细胞作核供体，供体细胞和重构胚均用5-aza-dC＋TSA 处理后对核移植胚胎体外发育的影响
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介